基金项目：河南省重点科技攻关项目（102102310094） 作者单位：450052 郑州，郑州大学第一附属医院急诊科，河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室 简历大全 http:///html/jianli/ 【摘要】目的 观察乌司他丁（UTI）对于百草枯（PQ）所致心肌损伤过程中自身抗氧化组分的影响，探讨UTI对PQ所致心肌氧化应激损伤有无保护作用及其机制。方法 30只日本大耳白兔随机（随机数字法）分配至5组：A组，空白对照；B、C、D、E组均通过腹腔注射总剂量为30 mg/kg百草枯，C、D、E三组分别应用15 000、30 000、50 000 U/（kgd）剂量静脉注射UTI干预7 d，后于麻醉中取动物左心室，行HE染色及4-HNE免疫组化染色，用碱水解法测定心肌组织羟脯氨酸（HYP）含量，用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测转化生长因子1（TGF-1）、脂联素（adiponectin）、过氧化物酶体增殖激素型受体（PPAR-）、依赖AMP激活型蛋白激酶1（AMPK-1）、解偶联蛋白1（UCP-1）转录水平。组间数据比较采用成组t检验，多组间采用One-Way ANOVA；两组及多组间等级资料分别用Mann-Whitney U检验及Kruskal Wallis秩和检验；UTI剂量与抗氧化组分转录水平间的关联性采用Spearman秩相关分析。结果 与A组相比，B组左室心肌细胞肿胀、纤维排列紊乱，4-HNE评分升至（2.370.49），P=0.001；HYP含量及TGF-1水平显著增高（均P=0.001）。与B组相比，应用UTI三组心肌纤维排列趋于正常，D、E两组4-HNE评分降低至（1.830.53）、（1.700.47），均P=0.001；组织HYP含量降至（3.510.39）g/mg及（3.290.37）g/mg，显著低于B组（P=0.002；P=0.001），TGF-1 mRNA水平同样显著降低（均P=0.001）。Adiponectin、PPAR-、AMPK-1及UCP-1 mRNA在E组心肌中水平均高于B组。Spearman秩相关分析表明UTI剂量与adiponectin、PPAR-、AMPK-1及UCP-1 mRNA水平间存在显著关联性。结论 UTI具有减轻PQ致心肌氧化应激损伤，这一作用与上调自身抗氧化系统组分有关。 思想汇报 http:///sixianghuibao/ 【关键词】乌司他丁；百草枯；兔；心肌；氧化应激损伤 Ulinastatin attenuates paraquat-induced myocardial injury LI Li，DI Min，LAN Chao，SUN Chang-hua. Department of Emergency， The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China 作文 http:///zuowen/ Corresponding author： LAN Chao， Email： lanchao29@163.com 【Abstract】Objective To investigate the effect of ulinastatin （UTI） on endogenous antioxidant systems in the process of myocardial oxidative stress injury induced by paraquat （PQ）， so as to elucidate UTI protecting cadiocytes against PQ-induced injury. Methods Thirty Japan white rabbits were randomly（random number）divided into A， a sham control group； B， PQ intoxication model group and C， D， E， three UTI groups as per different dosages of UTI given. PQ（30 mg/kg） was administered by intra-peritoneal route to the rabbits of PQ intoxication model and rabbits of three UTI groups. UTI in doses of 15 000， 30 000， 50 000 U/kg was administered intravenously every day to the rabbits of three UTI groups respectively for 7 days after PQ intoxication. After the rabbits were sacrificed with 10% chloral hydrate， left ventricles of rabbits were taken. Histomorphological changes of myocardium were observed by using HE staining. Hydroxyproline was measured by alkaline hydrolysis method， myocardial oxidative stress evaluated by 4-hydroxy-2-nonenal （4-HNE） immunohistochemistry staining， transcription levels of transforming growth factor-1 （TGF-1）， adiponectin， peroxisome proliferator-activated receptor （PPAR-）， AMP-activated protein kinase-1 （AMPK-1）， uncoupling protein-1 （UCP-1） were assayed with reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR）. The differences between two groups were analyzed by t test； for multiple comparisons， data were analyzed by One-Way ANOVA followed by Dunnetts post hoc test； for two and multiple ranked data comparisons， Mann-Whitney U test and Kruskal-Wallis test were used， and Spearman rank correlation analysis was used to investigate the correlation between UTI dose and transcription levels of endogenous antioxidant.Results Compared with group A， left ventricular cadiocytes in group B became swelled and disarranged， concentration of tissue HYP was elevated to （2.370.49），P=0.001；scores of 4-HNE and TGF-1 mRNA expressions were all upregulated （both P=0.001）. Compared with group B， disordered myocytes in UTI treated groups tended towards normal， 4-HNE scores in group D and group E descended respectively to （1.830.53） and （1.700.47），both P=0.001， HYP concentration reduced to （3.510.39）g/mg and （3.290.37）g/mg （P=0.002； P=0.001）， and expressions of TGF-1 mRNA in these two groups were decreased （both P=0.001）. Transcription levels of four endogenuous antioxidant components， adiponectin， PPAR-， AMPK-1 and UCP-1， were all augmented in the group E with high dose UTI. The mRNA expressions of these four components positively correlated with the dose of UTI in the myocardium of PQ intoxicated rabbits.Conclusions UTI could protect myocardia against PQ-induced injury by increasing endogenous antioxidant systems. 论文网 http://
【Key words】Ulinastatin； Paraquat； Rabbit； Myocardium； Oxidative stress damage 百草枯（paraquat，PQ），一种常用除草剂，可经皮肤、误服等多种途径，进入动物及人体肺、肾、脑及心脏多个器官，并于线粒体内通过反复与氧气结合产生过量的超氧游离基等形式的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），导致氧化应激（oxidative stress，OS）损伤而呈现出多脏器毒性，30%～70%的病死率近年仍无下降趋势[1]。心肌细胞富含线粒体，其对PQ所致氧化应激损伤更为敏感[2-3]。乌司他丁（ulistatine，UTI），一种由男性尿液内分离的相对分子质量约67 000的蛋白，除具抑制多种蛋白酶作用外，还具有清除自由基、抗氧化及稳定细胞膜等作用，广泛应用于胰腺炎或脓毒症引起的多脏器损伤、休克的治疗，另外，其减轻心肌再灌注损伤的作用也受到关注[4-5]，但UTI对于PQ所致心肌损伤的作用及机制尚不清楚。本研究通过监测不同剂量UTI对急性百草枯中毒兔模型心脏组织中基因及蛋白表达水平的影响，探讨UTI对PQ所致心肌损伤的作用及其对自身抗氧化系统的影响，以明确UTI对PQ所致心肌损伤的保护作用及机制。 简历大全 http:///html/jianli/ 1 材料与方法 1.1 动物分组及模型制作 代写论文 http:// 日本大耳白兔（SPF级，由郑州大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（豫）2011-0001），共30只，体质量1.71～2.43 kg，随机（随机数字法）分配至5组：A组，空白对照；B、C、D、E组均通过腹腔注射总剂量为30 mg/kg百草枯（美国Sigma）溶液（分3次注射，间隔48 h）制作百草枯中毒模型[6]。 简历大全 http:///html/jianli/ 1.2 乌司他丁药物干预 百草枯中毒模型完成后，C、D、E三组遂通过耳缘静脉分别以15 000[4]、30 000、50 000 U/kg剂量应用乌司他丁（广东天普生化）药物进行干预7 d。于最后一次给药24 h后，应用10%水合氯醛麻醉后，开胸并应用心脏采血后将动物心脏摘除，部分左心室固定于4%甲醛溶液行组织学分析，部分储存于-80 ℃冰箱备用。 总结大全 http:///html/zongjie/ 1.3 心肌组织羟脯氨酸（HYP）含量测定 应用样本碱水解法检测心肌组织内HYP含量[7]。称量80～100 mg低温干重心肌，于液氮中充分研磨后加水制备组织匀浆液，应用NaOH水解液120 ℃高温水解20 min，加入0.056 mol/L Chloramin-T（上海生工）后室温放置25 min，应用由二甲氨基苯甲酸（上海生工）丙醇过乙酸溶液配制的1 mol/L Ehrlichs试剂，65 ℃水浴20 min，3500 r/min离心10 min，取上清液应用NanoVue超微量分光光度仪（美国通用）于550 nm测定其吸光度（OD值）。通过与1 mg/ml HYP标准品（南京建成）OD值比较得各样本心肌HYP含量。 1.4 组织学分析 心脏组织于4%甲醛中固定24 h后行脱水及浸蜡后包埋，制作10 m心肌纵切面薄片行HE染色，了解各样本心肌组织形态学改变及纤维化程度[8]。 作文 http:///zuowen/ 1.5 免疫组织化学分析 将心肌组织切片经过脱蜡及梯度水化后封闭，以1∶100稀释的抗4-HNE（4-羟基-2-壬烯）抗体（美国santa cruz）于4 ℃孵育过夜，PBS冲洗后，滴加1∶200稀释的Biotin标记的二抗孵育10 min，加适量Streptavidn-HRP工作液（北京康为）室温孵育10 min，加适量DAB（北京康为）于组织切片显色，后应用自来水冲洗，并用苏木精复染，梯度脱水并透明后封片。各样本均取5张切片并应用DMI4000B照相系统（德国Leica）于400倍镜下观察4-HNE水平并以染色范围及深浅度评分：0，未染色；1，浅染面积50%；2，浅染面积50%或深染50%；3，深染50%[9]。 论文代写 http:// 1.6 RT-PCR分析 应用TRIzol（上海生工）提取各样本组织总RNA，经First cDNA Synthesis Kit（Formentas公司）反转录为模板链cDNA，并应用特异引物（表1）及DreamTaq Green PCR Master Mix （Fermentas公司）在PCR仪器（美国Applied Biosystems）扩增具促纤维化作用的TGF-1[10]，于心肌中具抗氧化作用的adiponectin、PPAR-、AMPK-1、UCP-1及内参-actin等基因；产物经琼脂糖凝胶电泳后于凝胶成像系统（美国UPV）显影并拍照，后通过Quantity One 4.4软件（美国Bio-Red）得各条带灰度值。各样本目的基因水平以-actin矫正的相对于空白对照组的相对表达量（relative quantification，RQ）表示。RT-PCR各基因引物序列见表1。 代写论文 http://
1.7 统计学方法 计量资料以均数标准差（xs）表示，数据通过SPSS 17.0统计软件处理。组间数据比较采用成组t检验，多组间应用One Way ANOVA检验（用Dunnett法两两比较）；两组、多组间4-HNE评分等级资料比较分别采用Mann-Whitney U检验及Kruskal Wallis秩和检验（用Bonferroni法两两比较）；UTI剂量与抗氧化组分转录水平间的关联性采用Spearman秩相关分析；以P0.05为差异具有统计学意义。 代写论文 http://
2 结果 2.1 PQ致心肌结构损伤、基因表达改变
与A组相比，PQ中毒模型之B组左室心肌细胞肿胀、纤维排列紊乱，脂质过氧化产物4-HNE水平增高至（2.370.49），显著高于A组（1.170.38），U=47.500，P=0.001，见图1；心肌组织内羟脯氨酸浓度及TGF-1 mRNA水平均显著高于正常水平（均P=0.001），见表2及图2。心肌PPAR-、AMPK-1 mRNA低于A组水平（P=0.001；P=0.032），而adiponectin及UCP-1转录水平差异无统计学意义 （P=0.295；P=0.142），见图3。 开题报告 http:///html/lunwenzhidao/kaitibaogao/
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发表于 2018-8-18 22:13:03