2018复方守宫散对Lewis肺癌小鼠JAK2-STAT3信号通路的研究策略

2037791

　　 .Oqb874 { display:none; } 我国，现代医学结合中医药治疗肺癌是一大特色，临床应用有效，本实验将Lewis廇小鼠作为研究体系，观察了中药与西药作用后癌基因STAT3信号通路相关蛋白JAK2 、STAT3 的表达，为中医药的临床运用提供实验依据。
　　
　　1材料与方法
　　1.1实验动物与细胞
　　C57BL/6J小鼠50只，体重（202） g，雄性，由安徽医科大学二附院动物房提供（动物许可证号：晥20130017 ） 。小鼠Lewis肺癌细胞（ Lewis lung cancer cell line，LLC）， 中国科学院上海生命科学研究院细胞库提供。
　　1.2模型建立
　　细胞培养：复苏小鼠Lewis肺癌细胞，贴壁生长于DMEM培养液中（含10%灭活胎牛血清及100U/mL青霉素、链霉素），置37℃、5%CO2培养箱中。约3d传一代，用0.25%胰酶消化。正常传3代后，胰蛋白酶消化法制成细胞悬液，台盼蓝染色计数活细胞率＞95%，用PBS液调整活细胞浓度为2107/mL，取0.2mL瘤细胞悬液接种于每只C57BL/6J小鼠右侧前肢腋下皮下。国家标准固体混合饲料喂养。接种6d后，以小鼠右侧前肢腋下皮下可触及米粒大小肿瘤块，标志造模成功。  总结大全 http:///hTml/zongjie/

　1.3分组与给药
　　随机分为阳性对照组、高剂量复方守宫散组、中剂量守宫散组、低剂量守宫散组、顺铂组，每组10只。实验第2天（造模成功24h后），阳性对照组：灌服生理盐水0.2mL，1次/d；中药组灌服复方守宫散高剂量组0.6mL（相当于120mg/kg），中剂量组0.4mL（相当于60mg/kg），低剂量组0.2mL（相当于40g/kg），1次/d；顺铂组按1mg/kg给药，0.1mL/只腹腔注射。每天1次，共14d。
　　1.4药品与试剂
　　（l）复方守宫散（安徽省中医院中药房）。（2）顺铂（江苏豪森药业股份有限公司，国药准字H200408l3，产品批号070902）。（3）①电化学发光（ECL）试剂盒：美国pierce公司 ；②actin（购自北京中山公司）；③DMEM培养基（美国Gibco公司生产）；④ 山羊抗兔二抗 、JAK2、STAT3（北京博奥森生物技术有限公司）；⑤10%胎牛血清（杭州四季青生物制品有限公司）。
　　1.5实验器材
　　水浴恒温振荡器，湘仪高速离心机，生物安全柜，光学显微镜，包埋机，手动石蜡切片机，摊片机，烘片机，智能化组织脱水机，电子天平，高速冷冻离心机，电泳仪，凝胶自动成像及分析系统等。
　　1.6观察指标
　　1.6.1肿瘤抑制率停药后第2日处死动物，完整剥取肿瘤，称重量，计算肿瘤抑制率。抑瘤率=（对照组平均瘤重-实验组平均瘤重）/对照组瘤重100%。  总结大全 http:///hTml/zongjie/

　　1.6.2瘤组织JAK2、STAT3蛋白测定采用Western blot 法。剪取肿瘤组织，称重，每个样品重量在100mg左右，加入RIPA细胞裂解液1mL（内含1mM PMSF）进行裂解。离心，收集上清液，即含有组织总蛋白。在收集的蛋白样品中加入等量的2X SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。沸水浴加热10min，以充分变性蛋白。待样品冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内。每孔加15L。浓缩胶所用电压为80V，时间为30min；分离胶所用电压为120V，时间为1h。将预先裁好与胶条同样大小的滤纸和PVDF膜（预先在甲醇中浸泡3min），浸入转膜缓冲液中5min。接通电源，恒流转膜。5%BSA在摇床上缓慢摇动，室温封闭2h。分别用一抗：抗beta-actin抗体，抗体属性为鼠抗；1︰1000稀释，10%的分离胶；抗Jak2、Stat3抗体属性为兔抗；1︰1000稀释，10%的分离胶抗。4℃缓慢摇动孵育过夜。加入洗涤液（TBST），每次洗涤10min，共洗涤3次。HRP标记的相应二抗1︰10000稀释液稀释，室温封闭2h。加入洗涤液（TBST），每次洗涤10min，共洗涤3次。用ECL发光试剂盒说明来检测蛋白。
　　1.7统计学方法
　　用SPSS17.0统计软件分析，计量资料采用（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用取LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。  论文网 http://wWw..coM
　　
　　2结果
　　2.1肿瘤组织病理切片结果
　　（1）目检：肉眼观移植瘤有完整包膜，易分离，肿瘤组织血供丰富，无明显周围组织和皮肤浸润，切面呈鱼肉样；（2）镜检：模型组：肿瘤细胞呈巢状，弥漫大片状分布，肿瘤细胞排列不规则，体积大，核大深染，异型性明显，核分裂相较治疗组多见，间质血管丰富，肿瘤组织中可见小灶性坏死，可见血管内瘤栓形成，侵犯周围肌肉及脂肪组织。其余治疗各组：DDP组肿瘤组织呈巢状、弥漫小片状分布，凝固性坏死面积较大，肿瘤细胞核固缩较中药组肿瘤组织明显，肿瘤细胞核分裂相减少，见大量核碎裂，血窦丰富，可见腺样良索状分布，中药各组均可见弥漫大片状分布肿瘤细胞，可见小灶性坏死，可见大量深染细胞核，巨核细胞、多核细胞。见图1~5。
　　
　　
　　图1灌服生理盐水阳性对照组（HE400）
　　
　　图2
　　
　　
　　图3
　　
　　
　　图4
　　
　　
　　图5
　　注：HE400，图1表示灌服生理盐水阳性对照组，图2表示灌服西药顺铂组，图3表示灌服中药复方守宫散高剂量组，图4表示灌服中药复方守宫散中剂量组，图5表示灌服中药复方守宫散低剂量组   http://www..com
　　2.2对小鼠肿瘤的影响
　　实验结束前称小鼠体重，脱臼处死小鼠后，迅速剥离瘤体，称重，计算抑瘤率。结果表明：各实验组对瘤重均具有一定的抑制作用，与阳性对照组比较瘤重明显减轻，差异具有统计学意义（P＜0.05）。西药组与中剂量、低剂量中药组比较，西药组瘤重较轻，差异有统计学意义（P＜0.05）。中药各组间比较，随着中药剂量的提高，抑瘤率逐渐提高，且差异有统计学意义（P＜0.05）。以上结果说明复方守宫散对肺癌小鼠有抑瘤作用，5组间两两比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。数据见表1。
　　
　　表1各组瘤重及抑瘤率比较（）
　　组别n
　　（起始总数/存活数）平均瘤重
　　（g）抑瘤率
　　（%）
　　阳性对照组10/7 2.910.24-
　　DDP组10/8 1.290.07*55
　　中药高剂量组10/8 1.420.06*#51
　　中药中剂量组10/8 1.580.06*#▲46
　　中药低剂量组10/8 1.820.05*#▲△37
　　
　　注：每组抑瘤率（%）=（对照组瘤重 - 实验组瘤重）/ 对照组瘤重100%。与对照组比较， *P＜ 开题报告 http://www..com/html/lunwenzhiDao/kaitibaogao/