2018结核菌特异性Elispot检测IFN—γ对肺结核病诊断及其治疗的指导意

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　[摘要] 目的 探讨结核菌特异性Elispot检测IFN-对肺结核病诊断及其治疗的指导意义。 方法 选择我院2011年1月～2014年12月收治的肺结核患者100例，所有患者入组期间均采用住院观察，并持续住院时间均在3 d以上，先行Elispot检测，1 d后行PPD实验，比较确诊患者Elispot检测结果与PPD实验结果、Elispot检测阳性与阴性结果中斑点形成细胞数与Elispot检测卡介苗接种前后IFN-分泌水平。 结果 卡介苗接种前后IFN-分泌中ESAT-6水平和PoolA水平差异无统计学意义（P0.05），Elispot检测阳性结果中斑点形成细胞数显著多于阴性（P0.05），Elispot检测法的阳性率为88.0%，灵敏度为90.5%，特异度为19.2%，PPD实验的阳性率为74.0%，灵敏度为76.1%，特异度为41.7%，Elispot检测法阳性率和灵敏度均高于PPD实验（P0.05）。 结论 结核菌特异性IFN- Elispot检测对于筛查肺结核感染患者具有明显优势，其不受接种卡介苗与否的影响，其阳性率和敏感性均显著高于常规PPD试验。　　[关键词] 结核菌特异性；Elispot检测；IFN-；肺结核　　[中图分类号] R52 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）33-0021-04　　研究显示，我国人群中被结核菌感染的比例在30%以上，而超过90%人群在结核菌感染后并不出现核感染的临床症状[1]。进入新世纪后，我国进行的结核病大样本普查发现，随着生活质量的改善和医疗水平的提高，结核感染率有所下降，但仍有接近50%的人群被结核所感染。也就是说，健康人群中存在大量的结核杆菌潜伏感染者，加上感染后发病者，我国结核病疫情已较为严重[2]。目前针对该部分结核感染初诊上最主要的方法是结核菌素试验（也称为芒图试验、PPD试验），该试验中许多患者虽然PPD试验阳性，但仍无临床症状，处于潜伏期，所以PPD试验在临床中对于区分真正结核感染者效果有限[3]。本研究主要探讨结核菌特异性Elispot检测IFN-对活动性肺结核病诊断及其治疗效果，现报道如下。　　1 资料与方法　　1.1 一般资料　　选择我院2011年1月～2014年12月收治的肺结核患者100例，所有患者均符合以下诊断标准：①具有典型的肺结核临床症状或胸部X射线检查明确的肺结核病灶；②痰液或支气管灌洗液涂片行抗酸染色结果阳性；③痰液或支气管灌洗液测定结核分枝杆菌体外培养结果阳性；④痰内聚合反应发现结核分枝杆菌DNA片段；⑤芒图试验强阳性，患者体内存在血清抗结核抗体且检查结果为阳性；⑥排除非结核性肺部疾病；⑦规律抗结核治疗患者临床症状、实验室检查、影像学检查均得到改善。符合①与⑦以及②～⑥中两项以上者。其中男46例，女54例，年龄18～50岁，平均（42.32.1）岁，肺结核病程1～20年，平均（6.31.2）年，肺结核类型：原发性肺结核（Ⅰ型）者19例，血行播散型肺结核（Ⅱ型）者26例，继发型肺结核（Ⅲ型）者55例。　　1.2 实验方法　　1.2.1 结核菌特异性 IFN-体外检测 收集通过乙二胺四乙酸进行抗凝后的晨起患者肘静脉血5 mL，使用Ficoll法对外周淋巴细胞进行分离，并采用Elispot法进行检测。所有患者于采血后2 h内对标本进行外周血单个核细胞分离。对分离细胞活化后将其包被于抗体平板上，每孔注入100 L，保持每孔的细胞浓度达到2105个以上，之后加入结核菌重组蛋白抗原（ESAT-6）、PoolA及卡介苗，保持终浓度为5 g每孔。随后盖上板盖，放置于37℃、5%二氧化碳温箱培养持续24 h。之后进行洗板，并加入待检测抗体，37℃条件下孵化1 h，再次洗板并加入亲和素孵化1 h。最后添加显色剂进行显色后最后洗板，计数Elispot斑点及其参数，以上所有操作均由具有5年以上工作经验的同一实验师严格按照说明书进行。采用酶联免疫斑点读板仪对斑点形成细胞数进行自动检测。结果判断：阳性：质控孔内斑点形成细胞数遍布整个反应孔，阴性为质控孔内存在5个以内斑点形成细胞数。　　1.2.2 PPD试验 每例患者均使用2个国际结核菌素单位，约0.1 mL由同一护士选择患者前臂内侧皮肤进行皮内注射，持续观察15 min后可自行活动，于3 d后观察结果，详细记录硬结的直径，质地、颜色、有无红肿破溃等。　　1.2.3 卡介苗接种 选择患者左上臂三角肌外侧下缘进行卡介苗的皮内注射，剂量为0.1 mL，所含菌量为0.5～0.75 mg。　　1.2.4 主要试剂 Elispot试剂由北京大学医学部生物实验中心研制，结核菌素由成都生物制品研究所提供，包被抗体和检测抗体均由eBioscience公司生产，酶联二抗由PierceBiotechonology公司生产，结核菌重组蛋白抗原（ESAT-6）由本院检验科制备，卡介苗由上海生物制品研究所提供。　　1.3 观察指标　　对所有患者入组前均签署知情同意书，并申报医院伦理委员会批准，根据入组标准确诊后抽取患者肘静脉血5 mL备用，所有患者入组期间均采用住院观察，并持续住院时间均在3 d以上，比较确诊患者Elispot检测结果与PPD实验结果，Elispot检测阳性与阴性结果中斑点形成细胞数与Elispot检测卡介苗接种前后IFN-分泌水平。所有患者均先进行Elispot检测，1 d后行PPD实验。灵敏度=真阳性人数/（真阳性人数+假阴性人数）100%，特异度=真阴性人数/（真阴性人数+假阳性人数）100%。