2018利用UPLCTQMS比较蟾酥鲜品和蟾酥商品化学成分

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　[摘要]蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufobufogargarizans或黑框蟾蜍B.melanostictus等近缘种的耳后腺分泌的白色浆汁加工而成，近年来多用于治疗各种癌症，有一定的攻毒抗癌、消肿止痛作用。研究表明其主要抗肿瘤成分为蟾蜍二烯内酯类。蟾蜍二烯内酯有游离型和结合型2种结构。该文通过超高效液相色谱质谱联用技术（UPLCTQMS）对中华大蟾蜍的蟾酥鲜品中蟾蜍二烯酸内酯类成分进行研究。采用UPLCTQMS的正离子多反应监测（MRM）模式。色谱条件：ACQUITYUPLCBEHC18色谱柱（2.1mm100mm，1.7m），柱温35.0℃，流速0.4mLmin-1，流动相0.1%甲酸超纯水溶液乙腈溶液。最终结合相关文献推导出蟾酥鲜品的37种蟾蜍二烯内酯成分，其中26种为游离型结构，11种为结合型结构。与蟾酥商品比较，二者之间有18种化合物存在显著差异，研究发现蟾酥的部分化学成分经加工处理后有很大的变化，7种结合型蟾蜍二烯内酯大量减少，11种游离型蟾蜍二烯酸内酯含量也随之明显改变，可能是在加工处理过程中蟾蜍二烯酸内酯部分结合型转化成了游离型。　　[关键词]蟾酥；LCMS；蟾毒配基；蟾蜍毒素　　蟾酥又称蛤蟆酥、蛤蟆浆、蟾酥眉脂等，是我国的传统中药。现代药理研究表明具有抗肿瘤、抗炎、局麻、强心、镇痛等多种作用。蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍BufobufogargarizansCantor或黑框蟾蜍B.melanostictusSchneider等近缘种的耳后腺分泌的白色浆汁加工而成，多于每年的510月采集。蟾酥的化学成分很复杂，主要有蟾蜍甾二烯类、强心甾烯蟾毒类、吲哚碱类、甾醇类以及其他多糖类，氨基酸，有机酸等。其中蟾蜍二烯酸内酯和吲哚生物碱被认为是具有强心和抗肿瘤作用的有效成分[1]。而蟾蜍二烯酸内酯根据是游离型和结合型又可分为蟾毒配基和蟾蜍毒素。蟾毒配基，至今已发现有20多种，如：蟾毒灵（bufalin），蟾毒它灵（bufotalin），华蟾毒精（cinobufagin），沙蟾毒精（arenobufagin）等。蟾蜍毒素（结合型类）多为蟾毒配基3位被精氨酸、二碳酸酯、硫酸酯等取代的衍生物[2]。　　现今关于蟾酥鲜品的研究报道较少。本实验以中华大蟾蜍的蟾酥鲜品为研究对象，采用超高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪（UPLCTQMS）进行进一步的研究分析，确定了蟾酥鲜品中游离型化合物26种，结合型化合物11种。并比较了蟾酥鲜品及蟾酥商品中蟾蜍二烯酸内酯成分的区别。　　1材料与方法　　1.1试剂与仪器　　蟾酥鲜品（2014年4月本实验室从江苏省南京市抓捕中华大蟾蜍耳后腺取得），蟾酥商品（购自山东省临沂药业有限公司，来自于中华大蟾蜍，经南京中医药大学中药鉴定教研室吴启南教授鉴定为蟾蜍属动物中华大蟾蜍的耳后腺分泌物）。　　色谱级甲醇（美国天地），甲酸（纯度95%，SigmaAldrich），色谱级乙腈（美国天地）。对照品脂蟾毒配基（Rbg），华蟾毒灵（Cbg），蟾毒灵（Bul），蟾毒它灵（Btl），日蟾毒它灵（Gtl），嚏更草苷元（Hel），沙蟾毒精（Arg），去乙酰蟾毒它灵（Deb），远华蟾毒精（Tel），华蟾毒它灵（Ctl）南京中医药大学方剂重点实验室自制，按HPLC归一化法测得对照品纯度均95%，且经质谱鉴定。　　WatersACQUITYUPLC系统（包括四元泵溶剂系统，在线脱气机和自动进样器，Waters公司，Milford，美国）；XevoTQ检测器（Waters公司）；MassLynxTM质谱工作站软件（Waters公司）；低温超高速离心机（美国Thermo公司）；EPED超纯水系统（南京易普达易科技发展有限公司）；电子分析天平（精度0.1mg，上海精密仪器厂）；KH3200B超声仪（昆山禾创超声仪器有限公司）；有机滤膜（天津津腾实验设备有限公司，0.22m）。　　1.2样品制备　　1.2.1实验组样品制备取5份25mg蟾酥鲜品（含水量经实验组多次实验计算为60%），每个样品加入5mL甲醇，超声仪超声提取30min。4℃14000rmin-1高速离心10min，取上清液。上清液用0.22m有机滤膜过滤，再取200L装于进样瓶中。　　1.2.2对照组样品制备取5份10mg蟾酥商品，每个样品加入5mL甲醇，超声仪超声提取30min。4℃14000rmin-1高速离心10min，取上清液。上清液用0.22m有机滤膜过滤，再取200L装于进样瓶中。　　1.2.3对照品制备10种对照品分别取1mg，溶于1mL甲醇溶液，涡旋混匀，4℃14000rmin-1高速离心10min，取上清液。上清液用0.22m有机滤膜过滤得质量浓度为1gL-1的母液。取适量母液稀释为2mgL-1-1得工作液，再取200L工作液装于进样瓶中。　　1.3液相色谱条件　　ACQUITYUPLCBEHC18色谱柱（2.1mm100mm，1.7m）；柱温35.0℃，流速0.4mLmin-1，进样量5L；流动相0.1%甲酸超纯水溶液（A）乙腈（B），梯度洗脱（0min，20%B；0～2min，20%～30%B；2～6min，30%～35%B；6～9min，35%～60%B；9～10min，60%～95%B；10～11min，95%B；11～11.20min，95%～20%B）。　　1.4质谱条件　　离子源为电喷雾离子源（ESI），正离子模式检测；质量扫描范围为MS120～1974，MS22～2048；毛细管电压3.00kV；锥孔电压30.00V；离子源温度150℃；脱溶剂气体流速998Lh-1；脱溶剂温度500℃；离子能0.5。　　1.5数据分析　　采用Waters公司的MarkerLynxXS软件进行数据的组间比较，用主成分分析（PCA）模型对蟾酥鲜品和蟾酥商品进行模式识别，利用有监督的OPLSDA模型排除与样品分类无关的信息，得到变量权重值（Variableimportantinprojection，VIP）。标记为VIP1的变量，具有统计学意义。同时筛选含量差异为1.5倍以上的甾体物质为组间差异标志物。　　2结果与讨论　　2.1蟾酥成分结构推导　　蟾酥主要抗肿瘤的化学成分为蟾蜍二烯酸内酯，分为游离型结构和结合型结构。其中结合型多为蟾毒配基3位被精氨酸二碳酸酯、硫酸酯等取代的衍生物[34]。游离型化合物为海葱甾二烯类化合物，C17位连接着吡喃酮环，主要为环氧与羟基取代两大类[56]。通过UPLCTQMS分析鉴定出蟾酥鲜品37种物质，化合物结构见图1，2，蟾酥游离型和结合型化合物的离子对信息见表1，2。质谱数据显示蟾酥中典型的化合物一般出现脱水和脱羰基的碎片，以gamabufotalin为例，一级质谱出现[M+H]+（m/z403）峰。二级质谱中有二级碎片离子m/z385，367，349，321，253，339等，与文献报道蟾酥结构质谱信息一致[79]。即gamabufotalin脱水得m/z385.23（C24H32O4）[M+H-H22O]+碎片离子，m/z367.22（C24H30O3）[M+H-2H2O]+离子，m/z349.21（C24H28O2）[M+H-3H2O]+离子。脱去羰基形成m/z339.23（C23H30O2）[M+H-2H22O-CO]+，m/z321.22[M+H-3H2O-CO]+碎片离子和m/z253.19（C23H30O2）[M+H-3H2O-96]+碎片离子等，见图3。结合文献分别推导出其他化合物结构，蟾酥鲜品中10种典型物质的谱图见图4。　　2.2数据分析　　2.2.1游离型与结合型化合物比较蟾蜍二烯内酯有游离型和结合型2种，采用UPLCTQMS检测到化合物峰面积大部分在E2～E5，不同物质所占比例不同，蟾酥鲜品及蟾酥商品2类化合物峰面积规律见表3，4。结果显示，游离型蟾蜍甾烯化合物在蟾酥鲜品和商品中均存在；结合型蟾蜍甾烯化合物主要存在于鲜品蟾酥中，在商品蟾酥中该类物质水　　平很低，部分化合物水平在检测限下。　　2.2.2蟾酥鲜品及蟾酥商品差异标志物的筛选将蟾酥鲜品及蟾酥商品含量数据导入MassLynxV4.1software（WatersCorp，Milford，USA）软件，进行数据的主成分分析（PCA），采用无监督的PCA统计方法进行了组间的区分，见图5。其中变量权重值为VIP1的变量，具有统计学意义，同时变量指标含量差异为1.5倍以上，由图5可看出蟾酥鲜品和蟾酥商品甲醇提取物的主要成分存在着明显差异。　　以蟾酥鲜品峰面积/商品峰面积倍数差1.5并且VIP1为标准，与商品比较，蟾酥鲜品的37种成分中存在18种游离型化合物下调，7种结合型蟾蜍甾烯水平上调，见表5。以成分含量相差10倍为标准，发现1种游离型甾烯（例如，arenobufagin）和7种结合型甾烯（例如，bufalin3succinatearginineester）发生差异。由此看出结合型蟾蜍甾烯成分水平在鲜品中水平远远高于商品。此外，部分游离型甾烯在鲜品中水平也高于商品，比如药典检测的2种质控成分resibufogenin和cinobufagin水平在鲜品中的含量均高于蟾酥商品。　　2.3方法学考察　　2.3.1标准曲线考察以苯海拉明（终浓度为20gL-1）为内标，5种蟾毒配基对照品为混标，质量浓度分别为16，80，400，2000，1万，5万gL-1，得到5种对照品的线性方程；分别采用S/N=3，S/N=10的浓度作为检测限，结果见表6。　　2.3.2精密度考察按上述相同梯度洗脱条件，取5种蟾毒配基对照品混标溶液，质量浓度为2000gL-1，1d内进行6次重复进样分析，测得其保留时间和峰面积等，分别计算其标准偏差，此为日内精密度，取5种质量浓度为2000gL-1的对照溶液在3d内进行6次重复进样分析，测得其保留时间和峰面积等，分别计算其标准偏差，此为日间精密度，结果见表6。　　2.3.3稳定性考察从精密度考察的样本中选出一个样本，按上述梯度洗脱条件，分别在0，2，4，8，　　12，24h时进样测定，结果见表6，供试品溶液中标准品24h内峰面积和保留时间无明显变化，说明供试品溶液在24h内化学性质稳定。　　2.3.4加样回收率考察取3种质量浓度（80，2000，5万gL-1）对照品混标样本100L，分别加入100L已知含量蟾酥商品样本，按上述梯度洗脱条件，测定加样回收率，平行进样3次，结果取平均值，并计算RSD。结果见表6，表明本法回收率高，测定结果准确，方法可行。　　3讨论　　蟾酥是蟾蜍耳后腺的分泌物，是蟾蜍受到外界刺激，合成并分泌的具有自我保护作用的毒性物质。蟾酥具有抗肿瘤、强心、局麻、镇痛、抗炎等多种作