[摘要] 目的 观察天然药物血竭素高氯酸盐（Dracorhodin perchlorate，Dp）对胶质瘤细胞U251和神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y抑制作用，并探讨其作用机制。 方法 于2013年12月～2014年12月期间采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测不同浓度Dp（0～100 M）z作用后细胞生长的抑制率；DAPI染色观察细胞形态学的变化；流式细胞术（FCM）检测Dp作用后细胞周期分布情况；Western blot检测凋亡相关蛋白以及增殖相关通路，并用小分子抑制剂确认通路靶点活化情况。 结果 血竭素高氯酸盐可以显著抑制胶质瘤细胞U251和神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的增殖（P0.05），并使细胞周期阻滞在G0/G1期，细胞周期相关蛋白Cyclin D1和CDK4的表达随Dp浓度增加而减少，与0 M组比，差异有统计学意义（P0.05）。增殖相关通路研究显示，血竭素高氯酸盐作用细胞24 h后Bax的表达明显增加，Bcl-2表达减少。p53蛋白的表达随药物作用浓度增加而上调，Caspase-3和Caspase-9活化形式表达随药物作用浓度增加而上调。下游信号通路显示，加入Dp后，MAPK通路中JNK和p38的磷酸化增强，加入对应的抑制剂SP600125（JNK抑制剂）和SB203580（p38 MAPK抑制剂）后，可以减少由Dp所引起的凋亡。加入不同的凋亡抑制剂后，z-DEVD-fmk和z-LEHD-fmk对Dp诱导凋亡的拮抗作用最明显（P0.05）。 结论 血竭素可以抑制胶质瘤细胞U251和神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的增殖，阻滞细胞于G0/G1期。血竭素高氯酸盐可以诱导细胞发生内源性凋亡，并且通过活化Caspase-3以及Caspase-9诱导细胞凋亡，加入凋亡抑制剂z-DEVD-fmk和z-LEHD-fmk可在一定程度上减少凋亡细胞比例。研究机制表明Dp可能通过活化MAPK通路中的JNK和p38发挥促进凋亡的作用，加入对应抑制剂后会显著降低Dp所诱导的凋亡。 [关键词] 血竭素；胶质瘤；凋亡；MAPK通路；JNK通路 [中图分类号] R739.41 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）31-0011-05 Dracorhodin inhibit proliferation and induce apoptosis to glioma cells by influencing MAPK pathway YU Jianjun1 CHE Xiaohang2 TAO Jin2 YE Xiaolei2 CHEN Yichen2 CHEN Xiaodong2 1.Department of Cerebral Surgery， the Affiliated Hospital of Ningbo University， Ningbo 315000，China；2.Medicine and Pharmacology Laboratory， Ningbo Institute of Medical Sciences， Ningbo 315020，China [Abstract] Objective To clarify the role and mechanism of a natural medicine dracorhodin perchlorate（Dp） on the proliferation of U251 cells and neuroblastoma SH-SY5Y cells. Methods The whole experiment was carried out during December 2013 to December 2014. The inhibition rate of of Dp with different concentration （0-100 M） was determined by methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide（MTT） assay. Cell morphology changes were observed after DAPI staining. Distribution of the cell cycle was analysised by Flow cytometry （FCM）. Changes of the apoptotic-related protein and the activation of downstream signaling pathway were determined by Western blot. Furthermore， the related inhibitors of downstream pathway were also added to confirm the influence of Dp. Results After treated with Dp， the proliferation of U251 cells and SH-SY5Y cells were significantly inhibited in a dose dependent manner （P0.05）， with G0/G1 phase cell arresting. And both of the cell cycle-related proteins， Cyclin D1 and CDK4， were significantly downregulated in Dp treated group compared with the control group. However， after treatment with Dp for 24 h， the expression of Bax and p53 were significantly upregulated， while the expression of Bcl-2 was downregulated. The activated form of Caspase-3 and Caspase-9 were both upregulated. For mechanism research， we found reinforced phosphorylation of JNK and p38MAPK after Dp treatment， and on the other hand， the related protein inhibitor SP600125 （JNK inhibitor） and SB203580 （p38MAPK inhibitor） could significantly reduce the cell apoptosis which was induced by different concentration of Dp. Furthermore， z-DEVD-fmk and z-LEHD-fmk were demonstrated to have the most significant effect on reversing the pro-apoptotic effect of Dp（P0.05）. Conclusion Dracorhodin can inhibit the proliferation of glioma cells U251 and neuroblastoma SH-SY5Y cells by blocking the cells in G0/G1 phase. Moreover， Dp induced cell apoptosis may be related to the activation of Caspase3/9， which is demonstrated by adding the related inhibitor z-DEVD-fmk and z-LEHD-fmk. The mechanism may be related to the activition of JNK and p38 MAPK pathway， which is embodied by a decreased apoptosis ratio after adding the related inhibitor of JNK and p38MAPK. [Key words] Dracorhodinperchlorate； Glioma cells； Apoptosis； MAPK pathway； JNK pathway 神经胶质瘤是起源于神经外胚层的肿瘤，约占成人颅内肿瘤的30%～50%。恶性胶质瘤生存期短，死亡率高，容易复发，治疗困难[1]。胶质瘤术后易复发，长期以来，单纯手术治疗恶性脑胶质瘤的5年存活率小于25%[2]。近年来手术配合放化疗取得了一定成效，但是化学药治疗过程中往往难以透过血脑屏障，长期应用后存在耐药等问题[1]，离彻底根治尚有较大距离，且放化疗所带来的不良反应严重影响患者生活质量。中医药在脑瘤治疗方面，能够在一定程度上保护健康脑组织，使大脑免受进一步损伤，在减少并发症和后遗症，预防和治疗脑瘤复发方面具有独特优势[3]。 血竭（Dracorhodin）为传统中药材，属于棕榈科植物麒麟竭果实及树干中的树脂。作为传统中药使用已经有1500多年的历史，1971年成功开发国产血竭后，在心脑血管系统疾病的治疗中取得了较好的疗效。其主要成分有血竭素、血竭红素等黄酮类化合物，此外还含有皂苷类、甾醇类、萜类和其他化合物。现代药理实验研究表明，血竭有抗炎止痛、抗真菌及抗血栓等药理作用[4，5]。近年来，不同的研究均显示血竭素对多种肿瘤细胞有显著的抑制效应。血竭素高氯酸盐可以诱导人宫颈癌Hela细胞[6]、胃癌SGC-7901[7]、人乳腺癌MCF-7细胞[8]、早幼粒细胞白血病[9]、前列腺癌PC-3[10]和人恶性黑色素瘤A375-S2细胞产生凋亡[11，12]，引起细胞的凋亡与线粒体途径以及MAPK的抑制等相关。但是目前尚未有血竭素对于脑瘤细胞作用的任何相关研究，因此，本次实验中采用人胶质瘤细胞U251和神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y为研究对象，探讨血竭素高氯酸盐对于上述细胞的细胞增殖、凋亡及周期的作用，并对相关作用机制进行探讨，为血竭素的进一步开发奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 血竭素高氯酸盐（dracorhodin perchlorate，Dp）购自中国药品生物制品检定所，含量以99.2%计。人胶质瘤细胞U251和神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y购于上海生化细胞所细胞库（上海），DMEM培养基（GIBCO，USA），胎牛血清（biological industries，Israel），Caspase抑制剂Z-VAD-FMK等（Merck Millipore，Germany），Caspase-3以及Caspase-9的活化形式，Bcl-2，p53，Cyclin D1，CDK4等抗体（Santa Cruz，USA）。Phospho-p38 MAPK （Thr180/Tyr182），Phospho-p44/42 MAPK （Erk1/2）（Thr202/Tyr204），Phospho-SAPK/JNK（Thr183/Tyr185）以及抗兔二抗为CST公司试剂盒（Phospho-MAPK Family Antibody Sampler Kit，#9910，Cell Signaling Technology， Inc.，USA）。96孔板（Corning Incoperated，USA），倒置显微镜（Leica，Germany），荧光显微镜（Leica，Germany）。Annexin V/PI双染试剂盒（BD Biosciences，USA）。 1.2 细胞增殖实验 分别将人胶质瘤细胞U251和神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y在DMEM中培养，以1105细胞/mL的细胞密度接种于96孔板中，每孔加入100 L细胞悬液，于37℃，5%CO2培养箱培养24 h。用完全培养液稀释血竭素高氯酸盐储液（10 mM），加入到细胞中，使终浓度分别为0、20、40、60、80、100 M，每个浓度均设置5个复孔，设置不加药物只加溶剂的对照组，放回培养箱，孵育48 h后，每孔加入MTT液（5 mg/mL）20 L，4 h后测定560 nm处细胞吸光度值（OD），利用下述公式计算抑制率（%）=（对照组OD-加药组OD）/对照组OD100%，得到细胞抑制率。 1.3 细胞形态学变化及DAPI染色 将神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y以1105细胞/mL的细胞密度接种于放有灭菌盖玻片的6 cm dish中，培养24 h后加入血竭素高氯酸盐，终浓度为0和80 M，分别于0、12、24、48 h用倒置显微镜观察。48 h取出盖玻片，使用4%多聚甲醛室温固定细胞30 min，PBS洗3次，加入DPAI染色液（50 g/mL），室温20 s，PBS洗3遍，取出玻片，倒扣到载玻片上，于荧光显微镜下观察。 1.4 细胞周期 将SH-SY5Y细胞以1105细胞/mL的细胞密度接种于10 cm dish中，分别加入血竭素高氯酸盐，使得终浓度为0、20、40、80 M，12 h后用胰酶消化细胞，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定后，加入PI（100 g/mL）4℃染色30 min。500目尼龙网过滤后，利用流式细胞仪进行检测，分析数据并观察细胞周期分布情况。 1.5 凋亡检测以及凋亡抑制剂干预 为了解Caspase蛋白酶抑制剂和MAPK激酶抑制剂等对血竭素高氯酸盐诱导U251和SH-SY5Y细胞死亡的影响，将SH-SY5Y细胞以1105/mL的细胞密度接种于96孔板中，培养24 h。加入一定浓度的caspase抑制剂：z-VAD-fmk（Caspase家族抑制剂），Ac-YVAD-cmk（Caspase-1抑制剂），z-DEVD-fmk（Caspase-3抑制剂），z-IETD-fmk（Caspase-8抑制剂），z-LEHD-fmk（Caspase-9抑制剂），z-AEVD-fmk（Caspase-10抑制剂），以上抑制剂终浓度为20 M。SB203580、PD98059、SP600125上述抑制剂终浓度均为10 M，培养1 h后再加入80 M血竭素高氯酸盐继续培养24 h后用Annexin V/PI双染后，上流式细胞仪测定细胞凋亡比例，并设置单染Annexin V或PI组用于设门。以右上和右下象限细胞比例为凋亡细胞比例，以上实验重复3次后取平均值用于统计分析。 1.6 免疫印迹 将SH-SY5Y细胞以1105/mL的细胞密度接种于6孔板中，培养24 h后，加入血竭素高氯酸盐，终浓度为0、20、40、80 M，24 h后弃去上清，冷PBS漂洗1次，用细胞裂解液RIPA冰上裂解细胞后提取蛋白，1 mL一次性注射器吹打断裂DNA，收获蛋白后，15 000 g离心5 min，取上清加入Loading Buffer 100℃煮沸5 min后-40℃备用，同时取2 L上清用于蛋白BCA试剂盒定量，根据蛋白定量结果，每个泳道加入25 g蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳。转膜至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h后，加入Caspase活化形式，p53，bcl-2，MAPK，以及周期相关蛋白等一抗4℃过夜。TBS-T漂洗3次，对应二抗室温1 h，TBS-T漂洗3次后，加入ECL发光液显色，拍照。 1.7 统计学方法 计量资料数据符合正态分布且方差齐性的表示为均数标准差（meansSD），独立两组间数据采用配对设计t检验进行比较，多组间比较使用单因素方差分析（one way ANOVA），如果方差不齐，采用Dunnetts T3方法；计数资料比较采用2检验。采用SPSS13.0软件进行统计学分析，P0.05为差异具有统计学意义。 2 结果 2.1 血竭素高氯酸盐对U251和SH-SY5Y细胞增殖的影响 U251和SH-SY5Y细胞培养48 h后，加入不同浓度的血竭素高氯酸盐，观察其对细胞的抑制作用。结果表明，血竭素高氯酸盐可以明显抑制U251和SH-SY5Y细胞增殖。在80 M时候抑制效应达到最大，继续增加浓度达到320 M后对抑制效率的提升不大。从细胞敏感性角度来看，SH-SY5Y对血竭素更为敏感，在80 M作用下抑制率可达到716%，因此，后续试验主要以SH-SY5Y为考察对象。见封三图1。 2.2 血竭素高氯酸盐对细胞形态的影响 光学显微镜下观察80 M血竭素高氯酸盐作用于SH-SY5Y细胞24 h后，细胞变圆，膜皱缩，产生凋亡小体（封三图2）。通过DAPI染色进一步观察药物处理后细胞核的形态变化。正常细胞核表面光滑，发出的荧光均匀，药物处理后细胞核皱缩，核膜附近产生空泡。且颜色较亮，说明出现核浓缩显现，而对照组中蓝色荧光分布均匀，细胞核大小相对均匀。 2.3 血竭素高氯酸盐对细胞周期的影响 血竭素高氯酸盐作用于SH-SY5Y细胞24 h后，流式检测细胞周期变化情况，结果显示，细胞主要阻滞在G0/G1期。周期相关蛋白Cyclin D1和CDK4蛋白随药物浓度增加表达减少，同样表明细胞大部分被阻滞在G0/G1期，说明血竭素对细胞周期的作用，主要为阻滞SH-SY5Y细胞在G0/G1期。见封三图3。 2.4 血竭素高氯酸盐对细胞凋亡的影响以及相关通路分析 对于Bcl-2和Bax的表达，0、20、40、80 M血竭素高氯酸盐作用SH-SY5Y细胞24 h后，western blot检测抗凋亡蛋白（Bcl-2）和促凋亡蛋白（Bax），结果显示，60 M血竭素高氯酸盐作用细胞24 h后Bax的表达明显增加，Bcl-2表达减少。此结果表明，血竭素高氯酸盐诱导SH-SY5Y细胞凋亡时改变了Bax/Bcl-2比例，提示可能激活线粒体途径（封三图4A）。对于p53的表达，0、20、40、80 M血竭素高氯酸盐作用SH-SY5Y细胞24 h后，western blot检测p53的表达情况，结果显示，p53表达随Dp作用浓度增加，表达量也增加。 利用不同的Caspase特异性抑制剂探讨血竭素高氯酸盐诱导SH-SY5Y细胞凋亡的具体途径，在SH-SY5Y细胞预处理1 h后，各种抑制剂在不同程度上抑制了80 M血竭素高氯酸盐诱导的细胞凋亡（封三图4B）。加入不同的凋亡抑制剂的结果显示，特异性Caspase-3抑制剂z-DEVD-fmk和Caspase-9 抑制剂z-LEHD-fmk能够极为显著的干预血竭素所引起的细胞凋亡效应（P0.01），提示血竭素可能主要通过Caspase-3/9途径诱导细胞发生凋亡。 2.5 MAPK信号通路在血竭素高氯酸盐诱导SH-SY5Y细胞凋亡中的作用 Western blot法进一步检测0、20、40、80 M血竭素高氯酸盐作用细胞24 h后细胞裂解液中ERK，JNK和p38等蛋白表达及活化情况，结果表明，血竭素高氯酸盐能够引起p38和JNK的磷酸化水平的增加，而对ERK的磷酸化水平上调不明显（封三图4C）。 为了进一步确定Dp是否通过活化MAPK引起细胞凋亡，选择MAPK家族的特异性抑制剂，SB203580（p38 MAPK抑制剂）、PD98059（ERK MAPK抑制剂）、SP600125（JNK MAPK抑制剂）加入到SH-SY5Y细胞中，预处理1 h后，加入Dp并使终浓度为80 M。收获细胞并进行Annexin V/PI双染，流式细胞仪检测凋亡细胞比例，结果显示，3种抑制剂在不同程度上削弱由80 M血竭素高氯酸盐诱导的细胞凋亡（封三图4D），尤其以SB203580最为显著（P0.01），提示血竭素可能主要通过影响p38 MAPK途径发挥作用。 3 讨论 目前癌症的治疗仍然以化疗放疗以及手术治疗为主，在此之中，化疗仍然是肿瘤治疗的主力军。随着研究的深入以及一系列临床实验的开展，过去单纯地进行新药研发已逐渐发展为新药研发合并治疗方案的革新以及老药新用。而另一方面，分子药理学与肿瘤药理学研究证明多靶点小分子药物可能对恶性肿瘤的控制具有更好的效果。中国作为以植物用药最早的国家，其传统的中药成分已逐渐被现代药理学所证明。中药具有取材天然、作用平和、毒副作用小等西药无法比拟的独特优点。而且中药中往往含有不少具有药理活性的天然大分子结构，不少在临床上广泛应用的天然化合物如紫杉醇、万古霉素等均无法通过人工手段合成，必须依赖生物发酵或提取等手段获得，因此，对于我国传统中药中具有活性价值的天然产物的药理活性的探索，将使得中医药进一步焕发新生。 近年来的研究显示，有50%～90%恶性肿瘤患者[13]常合并凝血功能的异常，患者的内皮系统损伤，凝血、抗凝系统失调，导致血液凝固性增高，出现血栓风险增加，这一状态也被称为血液的高凝状态，也称为血栓前状态[14]。血液高凝状态不仅是导致患者死亡的独立风险因素，而且可以通过多种机制引起肿瘤的转移而影响预后。多种传统中药常有活血化瘀成分，本研究中的血竭主要成分中含有较多而黄酮类化合物，已有研究证明其具有明显的抑制癌症患者血小板聚集、抗血栓、增强纤溶活性[15]。因此，在本研究中，我们探讨了血竭素对脑瘤细胞的药理作用，旨在明确血竭素本身是否具有一定的抗肿瘤作用，从而为血竭作为脑瘤的临床辅助治疗提供新的思路。我们的研究显示，血竭素能够抑制脑瘤细胞的增殖，并呈现一定的剂量依赖性。此外，流式细胞术证明血竭素可以阻滞胶质瘤细胞于G0/G1期，并诱导细胞凋亡，发挥其抗肿瘤作用。 诱导肿瘤细胞凋亡是抗肿瘤药物发挥治疗作用的重要途径。细胞凋亡也称为细胞程序性死亡，区别于坏死的主要特点在于不引起机体的炎症反应，通过形成凋亡小体，解构细胞，最后被人体的免疫系统清除。其发生主要通过2条途径实现，外源性途径：Caspase家族成员中位于上游的Caspase-8及-10由死亡受体Fas、TNF受体激活。而另一种内源性途径也叫线粒体途径，则是首先Bax 活化后使线粒体外膜通透性升高，引起细胞色素C释放到胞浆中，细胞色素C与Apaf-1结合激活Caspase-9前体后然后激活下游的Caspase-3等[16]。内外源性途径最终都通过顺次活化下游的caspase-3、-6和-7，引起Caspase的底物被降解，最终完成细胞凋亡的过程[17，18]。本研究中发现，血竭素高氯酸盐在高浓度作用下，可以引起脑胶质瘤细胞凋亡的发生，对其凋亡途径的研究显示，主要通过内源性途径实现，这体现在凋亡蛋白Bax以及活化形式的Caspase3/9均在Dp处理后显著上调，而抗凋亡蛋白Bcl-2则有下调趋势。此外，在另一方面，特异性Caspase-3抑制剂z-DEVD-fmk和Caspase-9 抑制剂z-LEHD-fmk也能够较为显著地干预血竭素所引起的细胞凋亡效应，这也同样证明Dp引发胶质瘤细胞凋亡主要通过线粒体途径发生。但是也有一部分的凋亡效应无法通过抑制剂加以逆转，这同时说明Dp可能还存在其他引起细胞凋亡的作用机制。为了更深入的研究Dp所引发的信号通路变化，我们还检测了p53蛋白在Dp作用后的表达。p53在细胞周期阻滞及诱导细胞凋亡中发挥重要作用，可以通过调节p21及Bax来实现不同的作用，DNA损伤后激活野生型p53基因，当上调了p21蛋白时，使细胞阻滞在G1期；如果p21被其他因素破坏后，细胞就会通过凋亡途径死亡[19]。我们的研究表明，Dp处理后p53表达显著上调，这说明Dp能够激活p53通路而引发后续的凋亡信号。此外，MAPK家族成员在凋亡的调控中起到了重要作用。在顺铂等化疗药物诱导的细胞凋亡中，p38和JNK的激活后可启动凋亡途径，活化后的JNK和p38通过促进细胞色素C等线粒体内促凋亡因子的释放，激活下游的Caspase家族[20-22]。我们的研究最终提示，MAPK信号通路JNK与p38 MAPK的激活是引发后续级联反应的重要诱因，继而上调p53并开启肿瘤细胞凋亡通路，最终发挥抗胶质瘤的作用。 本次研究中Dp引起细胞增殖抑制和凋亡的作用浓度较高，但是Dp的毒副作用相对较小，安全性高，对于小鼠的最大耐受量研究显示，以最大负荷给予小鼠灌胃，日剂量达到24g/kg，未见有任何毒副作用，3个月内无长期毒性反应[23]。 综上，我们认为血竭素在未来的脑胶质瘤研究中其临床应用价值有进一步挖掘的空间，不仅可以通过建立裸鼠移植瘤，考虑其在体内抗肿瘤的效果，而且可以探讨Dp联合临床常见化疗药物后，对于化疗药增效减毒方面是否存在有益的价值，传统中药在这个领域中发现很多有益的案例。血竭素作为中国传统中药中的一个案例，在脑科方面临床应用探索还只是开始，期待将来会有更多临床具体应用的报道。 [参考文献] [1] Belozertseva IV，Kos T，Popik P，et al. Antidepressant-like effects of mGluR1 and mGluR5 antagonists in the rat forced swim and the mouse tail suspension tests[J]. Eur Neuropsychopharmacol，2007，17（3）：172-179. [2] Frodl T，O'Keane V. How does the brain deal with cumulative stress？ A review with focus on developmental stress，HPA axis function and hippocampal structure in humans[J]. Neurobiol Dis，2013，52：24-37. [3] Zorrilla EP，Koob GF. Progress in corticotropin-releasing factor-1 antagonist development[J]. Drug Discov Today，2010，15（9-10）：371-383. [4] Tanaka M，Telegdy G. Antidepressant-like effects of the CRF family peptides，urocortin 1，urocortin 2 and urocortin 3 in a modified forced swimming test in mice[J].Brain Res Bull，2008，75（5）：509-12.
发表于 2018-8-18 19:28:01