2018猪组织中赛庚啶间接竞争ELISA检测方法研究

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　　酶联免疫分析方法（Enzyme-Linked Immuno-So rbent Assay， ELISA）具有特异性高、灵敏度高和成本低等特点，适用于现场监控和大量样本的快速筛选。本研究在前期制备的赛庚啶人工抗原和单克隆抗体基础上，建立了对猪组织中赛庚啶残留的间接竞争ELISA?z测方法，为后续检测产品研发奠定了基础。
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　　赛庚啶（Cyproheptadine，CLD）是一种具有抗胆碱能力和镇静作用，可用于治疗各种过敏性疾病的抗组胺药，也可用于改善患者食欲。近年来，人们发现在饲料产品中添加赛庚啶会增加动物食欲，可达到增加养殖动物体重的目的。但食用含赛庚啶残留的动物源性产品会对人体造成不利影响，浓度高时可直接引发昏厥、呼吸急促、全身无力等中毒症状，严重者则直接导致死亡。
　　农业部1519号公告将赛庚啶列入《禁止在饲料和动物饮水中使用的物质》，然而饲料安全预警监测结果表明，国内仍然有一些饲料产品中添加了此类药物，同时也有在猪肉组织中检出赛庚啶残留的报道。因此，加强对赛庚啶残留的检测迫在眉睫。目前，已报道的检测方法有液相色谱法、液相色谱-串联质谱法，而且多为动物尿液及饲料中赛庚啶残留的检测。因此，建立一种直接、方便、灵敏、高效、准确的检测方法十分必要。酶联免疫分析方法具有特异性高、灵敏度高和成本低等特点，适用于现场监控和大量样本的快速筛选。本研究在前期制备的赛庚啶人工抗原和单克隆抗体基础上，建立了对猪组织中赛庚啶残留的间接竞争ELISA检测方法，为后续检测产品研发奠定了基础。
　　材料与方法
　　材料与试剂
　　赛庚啶和可乐定标准品（98%中国兽医药品监察所）、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（美国Jackson）、四甲基联苯胺（华美生物工程公司）、小牛血清（杭州四季青）、牛血清白蛋白（美国SIGMA）、赛庚啶完全抗原和单克隆抗体（北京维德维康生物技术有限公司研发中心制备保存）；猪肉、猪肝等样本（超市）。甲醇、二氯甲烷、碳酸钠、氯化钠、氢氧化钠、碳酸氢钠、无水乙醇、乙酸乙酯、乙腈、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾均为分析纯级别（国药集团）。
　　仪器与设备
　　MK-3酶联免疫测定仪（Thermo）；QL-901涡动仪（海门其林贝尔）；TDL-40B离心机（上海安亭科学仪器厂）；酶标板（厦门云鹏）；氮吹仪（美国organomation）；移液器（Thermo）；精密电子天平（梅特勒-托利多）。
　　方法
　　1 ELISA检测条件的优化
　　1.1 最适包被浓度与最适单抗浓度的优化
　　将包被抗原以1：2000、1：10000、1：50000、1：250000稀释包板，每个稀释度包两条作为平行。比较各组的最大吸光度和抑制率，确定最适包被浓度。
　　单抗设定1：2000、1：10000、1：50000、1：250000共4组稀释度。比较各组最大吸光度和抑制率，确定最适单抗稀释倍数。
　　1.2 包被液pH的优化
　　分别用3种不同pH值的包被液将赛庚啶包被原稀释至最适工作浓度。比较各组最大吸光值、灵敏度点抑制、IC50值和曲线的线性，确定最适包被液pH。
　　1.3 封闭液的优化
　　分别用4种不同配方的封闭液封闭，37℃温育2h，其余变量相同。比较各组最大吸光值、灵敏度点抑制、IC50值和曲线的线性，确定最适封闭液配方。
　　1.4 包被条件的优化
　　用包被液将赛庚啶抗原稀释至最适工作浓度，每孔100μL，分成3组。第一组：37℃温育2h；第二组：室温放置2h；第三组：4℃过夜。比较各组最大吸光值、灵敏度点抑制、IC50值和曲线的线性，确定最适包被条件。
　　1.5 样品溶液与单抗溶液体积比例的优化
　　加入样品溶液和单抗溶液比例分别为：30μL：70μL、40μL：60μL、5 0μL ： 5 0μL、6 0μL ： 4 0μL、70μL：30μL和80μL：20μL。比较最大吸光度和抑制率，确定最适样品与单抗体积比例。
　　1.6 试剂盒特异性的确定
　　选择对赛庚啶类似物可乐定（Apraclonidine）、罗米非啶（Romifidine）、替扎尼定（Tizanidine）、赛拉嗪（Xylazine）、克伦特罗（Clenbuterol）、莱克多巴胺（Ractopamine）和沙丁胺醇（Salbutamol）进行测定，得到各类似物在标准曲线各点的OD值，应用 RIDAWIN软件分析，得出类似物的IC50，从而计算其交叉反应率（CR）：
　　交叉反应率（CR）=IC50（CLD）/ IC50（类似物）×100%
　　1.7 试剂盒精密度的测定
　　用零标准的OD值来测定ELISA方法的可重复性，分别测定板内差、批内差和批间差。
　　2 样本的添加回收试验
　　样本的前处理方法如下：
　　猪肉：准确称取2±0.01g均质后的新鲜组织样品于50mL离心管中；加入1mL 0.1M盐酸，再加入1mL无水甲醇，室温（25±2℃）下，充分涡动3min；4000r以上，离心10min；取100μL上清液于新的离心管中，再加入400μL 0.02M PBS，涡动30s混匀，然后进行检测。
　　猪肝：准确称取2±0.01g均质后的新鲜组织样品于50mL离心管中；加入0.5mL 0.1M盐酸，再加入0.5mL 1M EDTA-2Na溶液，最后加入1mL无水甲醇，室温（25±2℃）下，充分涡动3min；4000r以上，离心10min；取100μL上清液于新的离心管中，再加入400μL 0.02M PBS，涡动30s混匀，然后进行检测。   　　每个添加浓度做两份样品，每份样品的提取液做两个重复。各样品经上述方法处理后，用优化的ELISA方法检测，测定OD450值，用RIDAWIN软件分析数据，得出赛庚啶的含量，并根据下式?算添加回收率。
　　添加回收率（%）=实测值（ng/ mL）/添加值（ng/mL）×100%
　　结果与分析
　　ELISA检测条件的优化
　　1 最适包被浓度与最适单抗的优化
　　实验选择最大吸光值在2.0左右，灵敏度抑制率在80%以下为合适的抗原抗体稀释倍数。最适包被浓度与最适单抗的优化结果见表1、表2，由表可知，随着包被原浓度和抗体浓度的降低，最大吸光值也在降低，当抗原做1：50000稀释，抗体做1：10000稀释时，灵敏点抑制率为79.3%，最大吸光值和灵敏度抑制均符合要求，故确定其为最适稀释度。
　　2 包被液的优化
　　结果见表3，由表3可知，比较3种缓冲液的最大吸光值、灵敏度点的抑制率、IC50及曲线线性，选择0.05mol/L、pH=9.6的碳酸盐缓冲液做为包被液。
　　3 封闭液的确定
　　分析较几种常用的封闭液，结果见表4。选择最大吸光值较大，IC50较低，曲线线性大于99%，灵敏度点抑制在70%～80%之间的封闭液，最终选择5%的脱脂奶粉做为封闭液。
　　4 包被条件的优化分析
　　包被条件的优化见表5，实验选择最大吸光值较大，灵敏度抑制率为70%～80%，IC50在0.1ng/mL左右，线性相关系数在99%以上的数据，由表确定4℃反应16h作为试剂盒的最佳包被条件。
　　5 样品溶液与单抗溶液体积比例的确定
　　结果见表6，样品溶液与单抗溶液体积比为40：60时，灵敏度抑制率在70%～80%之间，最大吸光度值在2.0左右，线性相关系数为99.45%，因此确定样品溶液与单抗溶液体积比为40：60。
　　6 特异性的测定
　　结果见表7，该单抗与赛庚啶、可乐定、罗米非啶、替扎尼定、赛拉嗪、克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的交叉反应率分别为100.0%、0.1%、0.05%，其余均小于0.05%，表明对赛庚啶灵敏。
　　7 精密度的测定
　　精密度通常用标准样品的批内和批间相对标准差（RSD）或者变异系数（CV）来进行考察，一般要求CV应小于10%。精密度的测定见表8，由表8可以看出3批酶标板的板内变异系数小于5%，板间变异系数小于10%，符合要求。
　　样本的添加回收率检测
　　取空白样本各5份，根据检测限要求对样品进行添加，每种样本、每个浓度各做2个平行，按提取方法进行提取稀释，所得样本溶液进行ELISA检测，计算添加回收率。表9、表10表明两种组织的添加回收率均在70%～128%之间。
　　结语
　　本研究在已制备的赛庚啶抗原和单克隆抗体的基础上，对抗原浓度、抗体浓度、包被液配方、封闭液配方、包被条件等进行了摸索和优化，研制了检测猪肉组织中赛庚啶的ELISA方法，该方法IC50变动范围在0.1～0.15ng/mL之间，猪组织中检测限为0.5μg/kg，添加回收率70.0%～128.0%之间（添加浓度为0.5μg/kg和1.0μg/kg），样本重复检测的变异系数在2.6%～12.1%之间，具有良好的特异性、准确性和重复性，表明本ELISA方法的稳定性符合检测要求，能够满足对猪组织赛庚啶检测的需要。