[摘要]下肢缺血性疾病是临床常见的严重危害中老年人健康的疾病之一，目前治疗方法多样，一般采用药物、血管搭桥、介入手术等方式，但远期疗效较差，治疗效果往往不甚理想。近年来，脂肪干细胞在治疗下肢缺血性疾病方面的实验研究逐渐增多。本文拟就目前脂肪干细胞分化为血管内皮细胞及其治疗下肢缺血性疾病的研究现状作一综述，并对其存在的问题进行分析及展望。
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[关键词]脂肪干细胞；血管内皮细胞；下肢缺血；移植；分化
[中图分类号]Q813.1 R654.4 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2017）09-0122-03
Differentiation of Adipose-derived Stem Cells into Endothelial Cells and their Transplantation for Hindlimb Ischemia
XU Gui-zhen，JIAN Xue-ping，SUI Yun-peng，MA Li，LIU Yan-ping，WEN Hui-cai
（Department of Plastic and Cosmetic Surgery，the First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，Jiangxi，China）
Abstract： Ischemicdiseaseoflowerextremityisaseverediseasethreateninghumanhealth.Treatmentforischemicdiseasecommonlyusedrugs， vascular bypass，interventional surgery， but the long-term effect is unsatisfied.Thisreview aimstosummarizethedifferentiation of adipose-derived stem cells into endothelial cells and their transplantation for Hindlimb Ischemia， and to analyze current problems and to prospect the future.
Key words：adipose-derivedstemcells； vascularendothelial cells； hindlimb ischemia； transplantation；differentiation
?S着社会的发展和人口老龄化进程的加快，下肢缺血性疾病越来越困扰着中老年患者及其家人，已成为临床上严重危害中老年人群体健康的常见疾病之一。目前，临床针对下肢缺血性疾病的治疗方法多样，一般采用药物、血管搭桥、介入手术等方式，但远期疗效较差，对于肢体严重缺血的患者需要进行截肢处理，因此治疗效果往往不甚理想[1]。近年来，干细胞因其强大的多向分化能力和自我更新能力而不断被研究，在临床治疗下肢缺血性疾病方面得到广泛的应用。脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）不仅具有多向分化潜能和细胞因子分泌能力，更因其储量丰富，获取方便，免疫排斥反应弱，无伦理限制等特性，干细胞移植治疗展现了较好的临床应用前景，为下肢缺血患者带来新的希望。现将近年来ADSCs向血管内皮细胞分化的基础研究及其在下肢缺血性疾病中的应用进行综述。
1 ADSCs的生物学特性
ADSCs主要位于机体脂肪组织中，属于一种中胚层来源间充质干细胞，经胶原酶消化、离心、培养后所得。ADSCs在人类和动物体内获取方式不一样，人ADSCs可由脂肪抽吸或外科手术切取的方式获取，动物ADSCs可由腹股沟脂肪、内脏脂肪等部位获取。ADSCs的活性同时受到取材部位、方式以及供者年龄等因素的影响，一定程度上存在差异。在下腹部和大腿内侧获取的ADSCs其单位体积内的数量最高[2]。随着年龄增长，ADSCs老化程度更高，表现出??殖、分化及迁移能力的相应降低[3]。
研究表明ADSCs在低血清或者无血清的条件下也能生长，并且其诱导潜能不受影响[4]。在低糖、低氧和低谷氨酸等条件下，ADSCs的浓度是骨髓中干细胞的100～300倍[5]。ADSCs的传代培养平均倍增时间需要两天，在10代左右仍然能保持稳定的倍增率，且衰老和死亡的细胞比例出现的较少。以上说明ADSCs是间充质干细胞中易于培养和大量应用的种子细胞。
ADSCs由于其形态上与骨髓来源干细胞相似，因此无法从形态学上将两者进行区分。目前ADSCs尚无特异的表面标志物，ADSCs表面标志物也略有差别，主要受ADSCs培养方式的不同、细胞使用代数的变换、流式和免疫学检查使用抗体来源不一致等因素的影响[6]。最常用的是通过分化表型逆推的方式鉴定ADSCs，流式细胞仪来鉴定ADSCs。研究表明[7]，ADSCs阳性表达CD29、CD44、CD49、CD71、CD90、CDl05，Sca-1等抗原，阴性表达CD31、CD34、CD45等抗原，通过免疫标志对细胞进行有效筛选，可以得到较纯的干细胞，有助于ADSCs的进一步研究。
ADSCs可通过自身分泌或者旁分泌方式分泌抗炎、抗凋亡、免疫调节等因子。研究证实，ADSCs在缺血、缺氧及损伤的条件下可促进相关细胞因子的分泌，包括血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）、b型成纤维细胞生长因子（bFGF）、基质源性血管因子（SDF-1）、前列腺素E2（PGE2）等。Hao等[8]发现ADSCs可通过调节PGE2的表达影响巨噬细胞IL-10、IL-6、TNF-α细胞因子的分泌，为损伤组织的再生及修复提供适宜的微环境。 2 ADSCs向血管内皮细胞分化
2.1 在体外ADSCs向血管内皮细胞分化：ADSCs在条件培养基下可以向组织内多种细胞分化，在局部微环境下ADSCs能诱导分化成为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞以及心肌细胞等。作为间充质干细胞的一员，ADSCs具有跨胚层分化的潜能，可被诱导分化为血管内皮细胞。
Miranville等[9]的实验发现，在低浓度血清的培养基中，表面ADSCs可分化为具有功能性的血管内皮样细胞，特异性表达CD31标记物和第VIII因子相关抗原。Amos等[10]的报道表明，在血管内皮细胞生长因子和外来剪切力的作用下，ADSCs重新排列，表达血管内皮细胞表面标志物、周细胞表面标志物和血管干细胞相关分子；Volz等[11]研究证实，ADSCs与内皮细胞共培养，在表皮生长因子（EGF）、氢化可的松（Hydrocortisone）诱导下可向血管内皮细胞方向分化。以上说明ADSCs经过一定的环境诱导可向成熟血管内皮细胞分化。
2.2 在体内ADSCs向血管内皮细胞分化和迁徙：近年来，ADSCs参与血管构建过程，在许多研究中得到证实。此外，ADSCs被不断应用于移植治疗各种难治性疾病，如糖尿病溃疡、脑卒中、下肢缺血以及心肌梗死等，均表明ADSCs可改善缺血区域的供血和功能。新生血管生成主要包括两阶段，即血管发生和血管形成。血管发生主要是通过内皮祖细胞的分化、增殖、迁移，形成血管网，血管形成是在已经成熟的血管床基础上形成毛细血管。据此理论，学者们提出了治疗性血管形成和治疗性血管生成两个概念，为提高细胞治疗组织的存活率、治疗组织缺血性疾病提升了理论层次。由于ADSCs自分泌和旁分泌的作用特点，其不仅可以治疗血管形成，也可以治疗血管新生。Fischer等[12]研究证实，在内皮生长因子和外来剪切力的作用下，ADSCs可向成熟血管内皮细胞分化。Altman等[13]报道表明，植入的ADSCs在局部微环境下可以向血管内皮细胞方向分化。Borges等[14]将ADSCs和血管内皮细胞共同移植，能有效构建绒毛尿囊膜的微血管网络，发挥ADSCs促进血管生成的作用。总结归纳ADSCs促进血管再生的机制可能为：①ADSCs自我分化成血管内皮细胞参与新生血管的形成；②ADSCs在损伤局部自身分泌以及调节周边细胞表达多种细胞活性因子，促进局部血管新生，抑制细胞凋亡；③ADSCs与血管内皮细胞协同作用，从而促进血管新生。
3 ADSCs在下肢缺血中的应用
ADSCs是一种具有很强的自我更新能力和多向分化潜能的间充质干细胞，相比于脐带血间充质干细胞及骨髓来源干细胞，ADSCs具有储量丰富，获取方便，无免疫排斥反应，不受医学伦理问题束缚等优点，其在组织修复和再生医学的各个领域被广泛地研究。大量的研究证实，采用自体ADSCs移植治疗缺血组织，可以促进下肢缺血的恢复。
3.1 细胞治疗：近年来研究证实[15]，自体或者异体ADSCs移植治疗下肢缺血，其治疗结果是有效的。ADSCs可分化为成熟血管内皮细胞，并参与缺血下肢的微血管新生。在基因治疗领域，导入的外源基因在ADSCs体内能够稳定地表达，因此ADSCs可以作?槟康幕?因的载体。近年来有报道介绍通过病毒介导VEGF、HGF等基因转染，以及低氧预处理ADSCs，可以增强下肢缺血组织血管新生的能力。Shevchenko等[16]的研究用腺病毒介导的VEGF165基因转染ADSCs，其仍然保持了成脂、成骨的分化能力和粘附特性，血管生成素-1（Ang-I）基因的mRNA表达水平显著增加，而成纤维细胞生长因子-1（FGF-1）、干细胞生长因子（HGF）的水平无明显变化；将转染后的ADSCs与人工基质胶混合后植入小鼠皮下，发现ADSCs能够显著促进血管生成；用转染后的ADSCs注射移植到小鼠缺血下肢肌肉内，VEGF165在ADSCs中得到持续性的高表达，并且血流恢复速度明显优于未转染组。
3.2 组织工程（微凝胶）：游离的ADSCs移植注射到动物病灶区域，会出现大量流失和死亡现象，导致细胞治疗效率低、不稳定、重复性差[17]。因此，在临床治疗研究领域，寻找到一种高效、可控的方法应对以上问题显得尤为重要。Lee等[18]将ADSCs与含有成纤维细胞生长因子-2（FGF2）的可降解缓释凝胶共同注射到小鼠缺血下肢肌肉内，在注射后第4周和12周进行肌肉样本分析发现，联合处理后细胞存活率、新生毛细血管数量和相关促血管生长因子的表达量显著高于ADSCs悬液组和单纯FGF2凝胶组。以上结果表明FGF2缓释凝胶和ADSCs共同移植可提高干细胞移植到缺血区域的长期保留率和促血管再生能力。Li等[19]将ADSCs与可注射明胶微冰胶进行体外预培养，其目的是促进ADSCs间的相互作用形成3D微组织，积累大量细胞外基质和活性因子。然后通过注射器定点注射使其聚集在治疗区域，发现ADSCs可有效地应对机体病灶区域缺血、炎症等恶劣环境，并且3D微组织相当于传统游离细胞疗法十分之一的间充质干细胞的用量，就可使得患有下肢缺血性疾病的小鼠实现血管和肌肉组织再生，避免截肢的发生。该种可注射型可降解明胶微冰胶能与ADSCs相互作用，为ADSCs创造一个较好的微环境，使细胞在其中粘附、生长和增殖，减少细胞在缺血部位的死亡率和流失率，保证缺血局部有足够的细胞数量发挥治愈功能。Park等[20]通过3D培养法形成ADSCs球体混合基质胶注射到大鼠缺血患肢皮下，ADSCs能持续性地分泌各种细胞生长因子，起到促进患肢血管再生的作用，且治疗效果优于ADSCs悬液混合基质胶注射组，该种方法不仅能促进周围血管生长，同时能有效的促进内部血管生成。
3.3 物理辅助及其他联合治疗：2015年Prochroka等[21]学者提出一种鸡尾酒疗法，在含有多种细胞因子的人脂肪干培养基中，采用ADSCs培养基提取物治疗兔下肢缺血模型，研究表明治疗组下肢肌肉血管密度显著高于对照组，说明ADSCs在体内局部缺血环境下分泌的多种细胞因子也可直接起到治疗效果。2016年Yoshida等[22]报道使用ADSCs联合带蒂血管皮瓣治疗大鼠下肢缺血模型的创面，实验结果显示在联合治疗组的效果较单纯ADSCs治疗组和单纯带蒂血管皮瓣治疗组更好。Park等[23]提出使用ADSCs联合微光照射治疗小鼠下肢缺血，观察到效果比单纯注射更佳。 以上研究?@示，通过改变ADSCs的培养方式，或者联合其他治疗方法，都能有效改善ADSCs治疗下肢缺血的效果。
4 总结和展望
应用ADSCs治疗下肢缺血，是一项具有巨大发展潜力的医疗技术，可为一系列难治性疾病提供新的治疗方向，引起了各国临床医师、科研工作者及患者的关注。无论是基础研究还是临床研究均证实了ADSCs移植治疗下肢缺血性疾病的有效性。目前此技术的应用仍处于起步阶段，临床研究大多是单中心小样本报告病例总结式报告，未形成统一的评价标准，观察时间短，样本量少，说服力、科学性不强，未来亟待开展多中心前瞻性随机对照研究。另，理论研究尚未不完善，其治疗的安全性及有效性并没有充分的数据可以证实，更多的研究依然是集中在动物实验领域。随着研究的不断深入，ADSCs移植治疗下肢缺血的机制将会得到更全面、具体的解释，同时也将为下肢缺血等难治性疾病的防治带来更多思路和方法，能使更多患者受益。
[参考文献]
[1]Etsu，Suzuki，Daishi，et al.Adipose tissue-derived stem cells as a therapeutic tool for cardiovascular disease[J].World J Cardiol，2015，7（8）：454-465.
[2]Gir P，Brown SA，Oni G，et al.Fat grafting： evidence-based review on autologous fat harvesting， processing， reinjection， and storage[J].Plast Reconstr Surg，2012，130（1）：249-258.
[3]Kawagishi-Hotta M，Hasegawa S，Igarashi T，et al.Enhancement of individual differences in proliferation and differentiation potentials of aged human adipose-derived stem cells[J].Regn Ther，2017，6：29-40.
[4]Song SY，Chung HM，Sung JH.The pivotal role of VEGF in adipose-derived-stem-cell-mediated regeneration[J].Expert Opin Biol Th，2010， 10（11）：1529-1537.
[5]Dhanasekaran M，Indumathi S，Poojitha R，et al.Plasticity and banking potential of cultured adipose tissue derived mesenchymal stem cells[J].Cell Tissue Bank，2013， 14（2）：303.
[6]袁福康，秦金保，叶开创，等.脂肪干细胞治疗下肢缺血的研究进展[J].现代生物医学进展，2015，15（28）：5598-5600.
[7]Li K，Gao J，Zhang Z，et al.Selection of donor site for fat grafting and cell isolation[J].Aesthet Plast Surg，2013，37（1）：153.
[8]Hao C，Shintani S，Shimizu Y，et al.Therapeutic angiogenesis by autologous adipose-derived regenerative cells： comparison with bone marrow mononuclear cells[J].Am J Physiol-Heart C，2014，307（6）： H869.
[9]Miranville A，Heeschen C，Sengenès C，et al.Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells[J].Circulation，2004，110（3）：349.
[10]Amos P J，Shang H，Bailey AM，et al.IFATS Collection： The Role of Human Adipose-Derived Stromal Cells in Inflammatory Microvascular Remodeling and Evidence of a Perivascular Phenotype[J].Stem Cells，2008，26（10）：2682.
[11]Volz A C， Huber B， Schwandt A M， et al. EGF and hydrocortisone as critical factors for the co-culture of adipogenic differentiated ASCs and endothelial cells[J]. Differentiation，2017， 95： 21-30.
[12]Fischer LJ，Mcilhenny S，Tulenko T，et al.Endothelial differentiation of adipose-derived stem cells： Effects of endothelial cell growth supplement and shear force[J].J Surg Res，2009，152（1）：157-166. [13]Altman AM，Yan Y，Matthias N，et al.IFATS collection： Human adipose-derived stem cells seeded on a silk fibroin-chitosan scaffold enhance wound repair in a murine soft tissue injury model[J].Stem Cells，2009，27（1）：250.
[14]Borges J，Mueller MC，Padron NT，et al.Engineered adipose tissue supplied by functional microvessels[J].Tissue Eng，2004，9（6）：1263-1270.
[15]Sz?ke K，Brinchmann JE.Concise Review： Therapeutic Potential of Adipose Tissue-Derived Angiogenic Cells[J].Stem Cell Transl Med，2012，1（9）：658.
[16]Shevchenko EK， Makarevich PI，Tsokolaeva ZI，et al.Transplantation of modified human adipose derived stromal cells expressing VEGF165 results in more efficient angiogenic response in ischemic skeletal muscle[J].J Transl Med，2013，11（1）：138.
[17]Cheng AY， García AJ.Engineering the matrix microenvironment for cell delivery and engraftment for tissue repair[J].Curr Opin Bi，2013，24（5）：864.
[18]Lee TJ，Bhang SH，Yang HS，et al.Enhancement of long-term angiogenic efficacy of adipose stem cells by delivery of FGF2[J].Microvasc Res，2012，84（1）：1.
[19]Li Y，Liu W，Liu F，et al.Primed 3D injectable microniches enabling low-dosage cell therapy for critical limb ischemia[J].P Natl Acad Sci USA，2014，111（37）： 13511-13516.
[20]In-Su P，Kang JA，Jungmi K，et al.Therapeutic effect of human adipose-derived stromal cells cluster in rat hind-limb ischemia[J].Anat Rec，2014，297（12）： 2289-2298.
[21]Procházka V，Jur?íková J，La??ák O，et al.Therapeutic Potential of Adipose-Derived Therapeutic Factor Concentrate for Treating Critical Limb Ischemia[J].Cell Transplan，2015，25（9）：1623-1633.
[22]Yoshida S，Yoshimoto H，Hirano A，et al.Wound Healing and Angiogenesis through Combined Use of a Vascularized Tissue Flap and Adipose-Derived Stem Cells in a Rat Hindlimb Irradiated Ischemia Model[J].Plast Reconstr Surg，2016，22（2）：1486-1497.
[23]Park IS，Chung PS，Ahn JC.Enhanced angiogenic effect of adipose-derived stromal cell spheroid with low-level light therapy in hind limb ischemia mice[J]. Biomaterial，2014，35（34）：9280-9289.
[收稿日期]2017-01-18 [修回日期]2017-07-16
?辑/张惠娟
发表于 2018-8-17 17:53:23