2018Veriflow LS李斯特菌属快速检测技术性能验证

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　　目的：与美国农业部微生物实验室指南8.08章参考方法进行对比，验证Veriflow LS李斯特菌属定性检测方法的性能。方法及结果：本次性能验证研究采用了6种不同环境样品和食品基质来验证Veriflow LS方法对于检测低菌量李斯特菌的能力。在每个非配对的对比试验中，阳性检出率的结果显示，Veriflow LS的检测结果与参考方法无显著性差异。参考方法对Veriflow LS检测过的样品的确认的结果显示，Veriflow LS检测结果无假阳性和假阴性。同时对51个李斯特菌属和35个非李斯特菌属进行了包容性验证和排他性验证，结果显示包容性和排他性均为100%。总结：Veriflow LS是一个灵敏、选择性强、耐用的环境表面（不锈钢、混凝土、塑料和陶瓷的表面）和即食食品基质（热狗和熟火鸡肉）中李斯特菌属的检测方法。
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　　前言
　　李斯特菌属（Listeria）既包括默氏李斯特菌等无致病性的李斯特菌，还包括伊氏李斯特菌、威尔斯李斯特菌、格氏李斯特菌和单增李斯特菌等具有致病性的种属，其中单增李斯特菌对人类的危害最大，能够引起人体食物中毒，引发骨髓炎、脑膜炎、心肌炎、孕妇流产以及产褥感染等。李斯特菌属广泛存在于自然界中，在4℃的环境中仍可生长繁殖，故而已引起公共卫生和食品安全领域的广泛重视。正因如此，李斯特菌属的快速检测对于预防由该菌属引发的食物中毒和食源性疾病具有重要的指导意义。传统的李斯特菌属检测手段是培养法，包括预增菌（24h）、选择性增菌（24h）、选择性平板（48h）、生化反应等过程，是检验的“金标准”，但其费时费力、成本高、专业性强，显然无法满足快速检测的需求。目前李斯特菌属快速检测方法主要有免疫方法和荧光PCR法，虽都可有效缩短检测时间，但前者在致病菌检测时存在较高的假阳性和假阴性，而后者的前处理通常操作复杂（需要核酸提取），对操作人员的要求高，成本高且存在气溶胶引起的假阳性。因此，市场亟需一种更为简便、高效且特异性强的李斯特菌属快速检测方法。
　　Veriflow LS是基于DNA分子技术开发的李斯特菌属的快速检测系统，适用于环境表面和食品基质的检测，只需22小时的前增菌、60～90分钟的扩增和3分钟的层析检测，即可得出检验结果。该方法将PCR技术与垂直流层析系统结合，无需提取核酸，具有高特异性和高灵敏度，同时采用专利的酶系统有效降低了假阳性和假阴性。本次实验将Veriflow LS系统方法与传统方法进行对比，验证了Veriflow LS系统方法的性能。
　　1 方法原理
　　将采集的样品增菌，然后取增菌液用于PCR扩增，最后将扩增产物直接加入到层析卡盒的加样窗内，仅需等待3分钟即可产生反应信号。拉动检测卡盒上的开关，观察检测结果。检测结果为阳性时，靶标分析物被捕获并固定在测试膜上，在阳性线处生成视觉信号，在测试卡盒标记的“T”端，分析物聚集产生清晰的红色检测线；控制线同时在“C”区显现，表明实验的操作是正确的。两条红线表明样品为李斯特属阳性，而一条质控线则表明样品为李斯特属阴性。
　　2 实验器材及样品
　　对比方法（参考方法）：美国农业部微生物实验室指南8.08章参考方法。
　　样品基质：不锈钢表面、混凝土表面、塑料表面、陶瓷表面、热狗和熟火鸡肉。Veriflow LS所需器材：Veriflow LS李斯特菌属检测试剂盒（含PCR试剂、层析检测卡等）、IS PCR仪、移液器、金属浴加热器（95±2℃）。
　　菌?N：各菌株分别来自ATCC、BEI、佛蒙特大学、宾夕法尼亚大学、NCTC和NCIMB。所有菌株都经参考方法确认。
　　3 实验方法
　　3.1 实验用菌悬液准备
　　单核增生李斯特菌：将菌种培养物增菌并添到样品中，使样品的阳性率在20%～80%即可用于Veriflow LS耐用性测试和批次间稳定性测试。具体步骤如下：菌株接种于BHI肉汤中至稳定期（含量约为1.5×109CFU/mL），稀释，取稀释因子为108的稀释液100μL加入到50mL的李斯特肉汤中，混匀，从中取5mL加入到100mL李斯特肉汤中并于35±1℃培养22h。阴性对照菌：肠球菌ATCC 29212用BHI肉汤增菌直至稳定期，用于Veriflow LS耐用性和批次间稳定性测试。包容性测试菌株：51株李斯特菌属菌株分别增菌，释至50×LOD值（约为5.0×105CFU/mL），不经增菌直接上机检测。排他性菌株：35株排他性菌株增菌至稳定期，该浓度用于Veriflow LS排他性测试。
　　3.2 Veriflow LS检测流程
　　增菌方法：取样品与适量李斯特肉汤混合，均质，35±2℃培养22h。样品准备和PCR扩增：取增菌好的样品500μL增菌液加入到配套的采样管中，灭活10min后，移取5μL加到PCR试剂管中，放入扩增仪中并运行对应程序。层析检测：在已完成扩增的PCR管子中加入4滴缓冲液B，层析检测卡加样窗内，等待约3min，即可打开层析检测卡视窗获取结果（2h内打开有效）。结果判读：检测卡视窗内只有1条红线（控制线），表明样品为李斯特菌属阴性；检测卡视窗内有2条红线（控制线和阳性线），则表明样品为李斯特菌属阳性。
　　3.3 实验设计
　　3.3.1 耐用性验证
　　Veriflow LS系统参数改变时，低菌量阳性样和阴性样（非李斯特菌属）的检测和分析一定程度上会偏离标准参数，因此要进行耐用性验证。验证实验采用了析因设计（见表1），变更的参数分别为：灭活时间（8或12min±30s）、IS缓冲液B添加量（3滴或5滴）和LS层析检测卡层析时间（1.5或2.5min±15s）。
　　3.3.2 批次间稳定性测试   　　本次实验采用了3个独立生产的批次，批次号分别为ML0032、ML0035和ML0037，每个批次分别在0个月、6个月和12个月的时间点（通过加速老化完成）进行了如表2所示的验证实验。每个时间点分别采用10个含0～9个目标菌（10个样品中部分不含目标菌）的样品和5个含非目标菌样品进行验证，具体实验设计见表2。
　　3.3.3 特异性测试（包容性和排他性测试）
　　用准备好的包容性和排他性菌株菌悬液，不经增菌，按照Veriflow操作说明书进行分析检测。（注：所有包容性验证菌株的培养物都已经过参考方法确认。）
　　3.3.4 独立方法对比实验
　　实验目的为比较Veriflow LS检测方法和参考方法在检测环境表面样品与即食食品样品中李斯特菌属的性能差异。由于Veriflow LS和参考方法的前增菌培养基不同，本次实验对所有样品基质都采用独立的非配对方法进行分析检测。（注：每个Veriflow LS检测过的样品都经参考方法确认并确保Veriflow LS检测结果无假阳性或假阴性）。本次实验的每种样品都采用了30个样品进行实验，其中5个样品未添加目标菌（浓度为0CFU/采样量），20个添加了低含量目标菌（浓度为0.2～2CFU/采样量），另外5个添加了高含量目标菌（浓度为2～5CFU/采样量），并且每种样品都添加不同李斯特菌。设计低含量添加样品的目的是使20个样品中部分样品的结果为阳性，部分结果样品的结果为阴性，比例在5/20～15/20之间，以比较两种方法的结果是否存在阳性检出率上的差异。
　　环境表面样品：将两种检测方法（Verilow LS和参考方法）所采用的各类环境表面分别添加不同的李斯特菌以获得不同程度污染的表面。不锈钢表面和混凝土表面采样方法：10×10cm的表面添加0.25mL菌悬液并用Hygeina海绵棒采样。陶瓷和塑料表面采样方法：2.5×2.5cm表面添加0.10mL菌悬液并用Hygeina Q-Swab拭子采样。除添加李斯特菌之外，不锈钢表面还添加了高于目标菌（李斯特菌）含量10倍的竞争性菌―粪肠球菌ATCC 29212。取样前所有表面都在室温（24±2℃）下自然风干16～24h，菌悬液都采用TSA培养基进行计数。采样完成后，可按照两种方法各自的操作说明进行后续检测。
　　即食食品样品：两种食品基质添加了不同的李斯特菌。对每种食品基质添加阳性培养物稀释液后在4±1℃下放置48～72h，将样品分成适当份数并分装于均质袋中，增菌并进行后续检测。（添加的李斯特菌在50±2℃下热应激10min便已失去50%的活力）。用MPN法对样品中李斯特菌含量进行计数。采样完成后，按照两种方法各自的操作说明进行后续检测。
　　3.3.5 数据统计
　　POD：在一定基质和一定待测物浓度下，定性分析方法获得阳性分析结果数的比例。POD值与浓度有关，POD的计算公式为POD=阳性结果数量/试验总数。以下几个POD值分别为：PODR（参考方法POD），PODC（被评估方法POD），在95%的置信区间内评估POD值，包括PODR、PODC。
　　dPOD：两个POD值之差，dPODC=PODC-PODR，计算dPODC的95%的置信区间。若置信区间不包括0，则两种方法存在显著性差异，反之则不存显著性差异。
　　4 结果
　　4.1 耐用性和批次间稳定性结果
　　耐用性测试结果（见表1）显示，在不同参数（包括灭活时间、缓冲液B添加滴数和层析卡层析时间）结合改变下，Veriflow系统性能不受影响，并且所有结果用参考方法进行阳性确认后都为真阳性。这些结果表明，一些系统参数的改变不会对系统的性能产生影响。
　　批次间稳定性结果（见表2）显示批次间稳定性良好，每个批次和时间点的层析检测卡具有一致的性能表现。这一结果同时也表明，Veriflow LS具有至少12个月的稳定保质期。
　　4.2 包容性和排他性测试
　　实验结果显示，Veriflow LS准确无误地检测出了51株不同的李斯特菌属。另外，排他性结果显示，Veriflow LS系统能够准确无误辨别李斯特菌属之外的杂菌。（注：屎肠球菌ATCC 19434在非选择性增菌培养基增菌后上机检测出现了假阳性，但采用选择性增菌培养基（ISLB）增菌后上机检测则为阴性。）
　　4.3 环境样品结果比较
　　4种表面上分别添加3个不同浓度（不添加菌、低菌量和高菌量）的不同菌，采样，最后用各自的方法进行检测。添加低菌量表面的检测对比结果显示，Veriflow LS系统方法和参考方法在不锈钢表面样品分别检出12和8个阳性样本，混凝土表面样品分别检出15和14个阳性样本，陶瓷表面样品分别检出8和11个阳性样本，塑料表面样品两种方法则分别检出了8和11个阳性样本。4种表面中，未添加李斯特菌属的表面两种方法的结果均为阴性，添加高菌量的表面两种方法的结果均为阳性。所有Veriflow LS的结果都经参考方法确认，无假阳性和假阴性。同时，POD的分析结果显示，Veriflow LS系统和参考方法的结果均不存在显著性差异。
　　4.4 即食食品样品结果对比
　　添加3个不同浓度李斯特菌属的即食食品分析结果显示：Veriflow LS系统方法和参考方法在20个低污染的熟火鸡肉样品（0.22CFU/125g）中分?e检出了8例和7例阳性，20个低污染的热狗样品中各自都检出了13例阳性。两种即食食品中，未添加李斯特菌属的样品两种方法的结果均为阴性，添加高菌量的样品两种方法的结果均为阳性。所有Veriflow LS的结果都经参考方法确认，无假阳性和假阴性结果。同时，POD的分析结果（见表3）显示，Veriflow LS系统的结果和参考方法的结果不存在显著性差异。
　　5 讨论与结论
　　本次实验结果表明，与传统参考方法相比较，Veriflow LS检测系统在检测环境（不锈钢、混凝土、塑料和陶瓷的表面）和即食食品（热狗和熟火鸡肉）中李斯特菌属时具有很好的特异性、准确性和可靠性。6种基质的POD值数据分析均显示，Veriflow LS系统方法的和参考方法的性能不存在显著性差异。高特异性（包容性和排他性）也是本次验证实验成功的关键之一，特异性试验的结果显示，Veriflow LS系统能准确无误的识别出样品李斯特菌属而不受其他非李斯特属的杂菌的干扰，有效提高检出率。
　　Veriflow LS李斯特菌属检测系统无需复杂的前增菌过程，也无需复杂的前处理（无需DNA提纯），且经多种表面样品（海绵棒或拭子采样）和食品基质的验证，具有良好的准确度，可为终端用户提供灵活便捷的使用体验。同时，相较于参考方法中冗长的实验流程（参考方法需3～4天的检测时间），Veriflow LS检测系统能节省大量的时间―只需24小时的前增菌和2小时的扩增时间即可获得准确的结果。批次间的稳定性测试也表明，Veriflow LS的试剂盒是具有重复性好、耐用和生产质量稳定等优点的李斯特菌属检测试剂盒。本次实验的结果也表明，操作简单的Veriflow LS检测系统可以提供一种灵敏、可靠和易用的环境样品和食品基质中的李斯特菌属的检测方法。