[摘要]目的 探?姜黄素对大鼠肝纤维化防治作用的机制，为临床治疗提供参考。方法 建立CCl4致大鼠实验性肝纤维化的模型，同时每只大鼠按每100克体重分别给予20、10、5 mg姜黄素进行灌胃处理，相应设定为模型给药组、模型组以及对照组，每组各10只大鼠。比色法检测血清组织内活性氧类物质（ROS）水平；丙二醛（MDA）测定试剂盒（TBA法）检测肝组织MDA含量；凝胶迁移实验（EMSA）检测肝组织NF-κB活性；免疫组织化学法检测肝组织中NF-κB表达、转化生长因子-β超家族（TGF-β1）、血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）、重组人结缔组织生长因子（CTGF）水平；RT-PCR法检测肝组织基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）的mRNA水平。并对各组检测结果进行统计分析。结果 模型组大鼠的ROS、内毒素、MDA、NF-κB、TGF-β1、PDGF-BB、CTGF、TIMP-1mRNA水平均明显高于对照组，差异有统计学意义（P http://
[关键词]姜黄素；大鼠；肝纤维化；肝星状细胞；增殖；凋亡
[中图分类号] R575.204 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）11（c）-0004-03
Study of Curcumin on hepatic stellate cells in rats
WU Xiong-jian1 ZHENG Hong2 ZHU Hai-yan1 MAO Zhong-yi1 XIE Jun1
1.Department of Gastroenterology，the First Affiliated Hospital of Gannan Medical College，Ganzhou 341000，China；2.Gannan Medical College，Jiangxi Province，Ganzhou 341000，China
[Abstract]Objective To explore the mechanism of Curcumin on the prevention and treatment of liver fibrosis in rats，so as to provide reference for clinical treatment.Methods The rat model of experimental liver fibrosis induced by CCl4 was established.At the same time，20 mg，10 mg and 5 mg Curcumin were in lavage in every 100 g body weight，the corresponding models were set as delivery model group，model group and control group respectively，10 rats in each group.The level of reactive oxygen species （ROS） in serum was detected by colorimetric method.Malondialdehyde （MDA） content in liver tissue was detected by MDA assay kit （TBA method）.By electrophoretic mobility shift assay （EMSA），the activity of NF-κB in liver tissue was detected.The levels of NF-κB expression，TGF-β1，platelet-derived growth factor-BB （PDGF-BB） and recombinant human connective tissue growth factor （CTGF） in liver tissue were detected by immunohistochemistry.The mRNA level of tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in liver tissue was detected by RT-PCR.The results after detection were statistically analyzed.Results In the model group，the levels of ROS，endotoxin，MDA，NF-κB，TGF-β1，PDGF-BB，CTGF and TIMP-1mRNA were significantly higher than those in the normal group，and the differences were statistically significant （P [Key words]Curcumin；Rat；Hepatic fibrosis；Hepatic stellate cells；Proliferation；Apoptosis
肝纤维化是由多种原因引起的慢性肝损害所致的病理改变，表现为肝内细胞外间质成分过度、异常地沉积，并影响肝脏的功能，是慢性肝病发展到肝硬化的必经阶段。肝纤维化的形成和发生机制极为复杂，由于对这种复杂的发病机制尚未认识清楚，故肝纤维化的临床治疗一直未取得突破性进展[1]。近年来，中医药在治疗肝纤维化方面显示了广阔的前景，由于中药具有多层次、多靶点的综合药理作用，对肝纤维化复杂的发病机制有一定的针对性，已受到广泛重视。姜黄素是从中药姜黄根茎中提取的一种酚性色素，具有广泛的药理作用，包括抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒等，尤其是可以诱导多种肿瘤细胞凋亡，引起人们的研究兴趣[2]。肝星状细胞增殖与凋亡的失平衡是肝纤维化发生的细胞生物学基础，活化肝星状细胞产生大量的细胞外间质，抑制其降解，使细胞外间质大量沉积，肝纤维化发生。抑制其活化和诱导凋亡是治疗肝纤维化的重要策略，通过肝星状细胞凋亡，去除了细胞外间质的来源，促进了细胞外间质的降解，肝纤维化得以恢复[3-5]。本研究在原有工作基础上设想，姜黄素也可能通过诱导肝星状细胞凋亡，进而在肝纤维化的治疗中发挥作用，并进行实验研究，以期明确姜黄素抗肝纤维化的作用机制，为肝纤维化的防治提供新的途径，现报道如下。
1对象与方法
1.1对象及试剂
雄性成年SD大鼠30只，合格证号：SCXK（渝）2010-2012，180～200 g。姜黄素购自Sigma公司，检测试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司。
1.2方法
建立CCl4致大鼠实验性肝纤维化的模型，同时每只大鼠按每100克体重分别给予20、10、5 mg姜黄素进行灌胃处理，相应设定为模型给药组、模型组以及对照组，每组各10只大鼠。用二氯亚甲基二磷酸盐处理SD大鼠后，以原位胶原酶灌注结合密度梯度离心法分离大鼠肝星状细胞，并计算细胞得率和细胞活力，进行细胞的鉴定和培养。
肝星状细胞与姜黄素孵育后，以MTT比色法检测姜黄素对肝星状细胞增殖的影响，用流式细胞术分析姜黄素对肝星状细胞细胞周期的影响，并用流式细胞术、透射电镜和琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。
比色法检测血清ROS水平；TBA法检测肝组织MDA含量；EMSA检测肝组织NF-κB活性；免疫组织化学法检测肝组织中NF-κB表达、TGF-β1、PDGF-BB、CTGF水平；RT-PCR法检测肝组织TIMP-1的mRNA水平。并对各组检测结果进行统计分析。
MTT比色法操作流程：①收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100 μl，铺板使待测细胞调密度至1000～1 0000孔（边缘孔用无菌PBS填充）。②5%CO2， 37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物，原则上细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但常在前一天下午铺板，次日上午加药。一般5～7个梯度，每孔100 μl，设3～5个复孔，建议设5个，否则难以反应真实情况。③5%CO2，37℃孵育16～48 h，倒置?@微镜下观察。④每孔加入20 μl MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2～3遍后，再加入含MTT的培养液。⑤终止培养，小心吸去孔内培养液。⑥每孔加入150 μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490 nm处测量各孔的吸光值。⑦同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。
RT-PCR法操作流程：从细胞或特定组织中提取总RNA；逆转录实验；扩增内参和目的基因并比较基因表达差异。检验操作所需试剂盒均购自上海居里生物科技有限公司。
1.3统计学方法
采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验；计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验，以P 本研究中，以对姜黄素对大鼠肝纤维化防治作用的机制进行分析探讨为目的，建立了CCl4诱导肝纤维化的大鼠模型，并展开了分组实验，对比观察了模型组、模型加姜黄素组与正常对照组大鼠的ROS、MDA、NF-κB、TGF-β1、PDGF-BB、CTGF、TIMP-1mRNA水平，结果提示，模型组大鼠的ROS、内毒素、MDA、NF-κB、TGF-β1、PDGF-BB、CTGF、TIMP-1mRNA水平均高于正常组，差异有统计学意义（P参考文献]
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（收稿日期：2017-08-21 本文编辑：孟庆卿）
发表于 2018-8-17 12:47:53