[摘要] 目的 ??建荷载LOXP-DsRed-LOXP系统的细胞，并探索该系统在体内外检测Cre酶活性中的应用。 方法 构建稳转株MCA38LOXP-DsRed-LOXP并体外验证检测Cre酶效能。将Balb/c裸鼠随机分为两组（n=10），分别在结直肠黏膜下移植MCA38Cre-Luciferase与MCA38Luciferase细胞株，两周后取灌肠液作用于MCA38LOXP-DsRed-LOXP，验证该系统体内检测Cre酶效能。APCLOXP/LOXP小鼠随机分为两组（n=20），分别使用可表达Cre酶及荧光素酶（Luciferase）的慢病毒颗粒（CL组）与仅表达Luciferase的慢病毒颗粒（L组）行小鼠结直肠黏膜下注射，感染后第3天及第3周末取灌肠液检测Cre酶活性及表达情况，同时行小鼠活体成像检测Luciferase表达情况，验证该系统在判断Cre酶活性与预测基因修饰成功率中的应用。 结果 Cre重组酶作用于MCA38LOXP-DsRed-LOXP48 h后，红色荧光明显减弱。裸鼠灌肠液作用于MCA38LOXP-DsRed-LOXP细胞株48 h后，MCA38Cre-Luciferase组红色荧光明显减弱。CL组模型鼠病毒注射后第3天检出16只小鼠荧光素酶及灌肠液Cre酶阳性，第3周末8只小鼠荧光素酶及灌肠液Cre酶阳性。L组模型鼠病毒注射后第3天检出17只小鼠荧光素酶阳性而灌肠液Cre酶均阴性，第3周末检出8只小鼠荧光素酶阳性，灌肠液Cre酶均阴性。 结论 成功构建Cre酶检出系统MCA38LOXP-DsRed-LOXP，实现了体内、外无创性检测Cre酶活性及表达情况，并以此评价APCLOXP/LOXP小鼠结直肠黏膜基底干细胞病毒感染效率及基因修饰情况。
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[关键词] Cre酶；DsRed荧光蛋白；LOXP-DsRed-LOXP系统；结直肠癌
[中图分类号] R735 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）11（c）-0004-05
Construction and application of LOXP-DsRed-LOXP system
SONG Dan ZHENG Yongbin TONG Shilun XIAO Kuang YANG Chao SUN Wei QIN Kaidi
Department of Gastrointestinal Surgery， Renmin Hospital of Wuhan University， Key Laboratory of Hubei Province for Digestive System Disease， Hubei Province， Wuhan 430060， China
[Abstract] Objective To Establish a cell line contains the LOXP-DsRed-LOXP system， in order to study its application in detecting the activity of Cre recombinase in vitro and in vivo. Methods MCA38LOXP-DsRed-LOXP cells were established to validate its ability of detecting the activity of Cre recombinase in vitro. Balb/c nude mice were randomly divided into two groups （n=10）. MCA38Cre-Luciferase and MCA38Luciferase cells were transplanted in colorectal mucosa respectively and then collected enema two week later to validate its ability of detecting the activity of Cre recombinase in vivo. APCLOXP/LOXP mice were randomly divided into two groups （n=20）. Lentivirus expressing Cre and luciferase enzyme or expressing luciferase only were injected to colorectal mucosa respectively. Enema were collected at the 3rd day and 3 weeks later the activity of Cre recombinase was detected. Meanwhile， the in vivo imaging of mice was applied to detect the expression of luciferase. The application of this system in detecting the activity of Cre recombinase and predicting the success rate of gene modification was verified. Results The results showed that the red fluorescence was significantly faded in MCA38 LOXP-DsRed-LOXP cells which was modificated by Cre recombinase for more than 48 hours in vitro. Besides， the red fluorescence of MCA38LOXP-DsRed-LOXP cells treated with nude mice enema for more than 48 hours was significantly faded in MCA38Cre-Luciferase group. In group CL， Luciferase and Cre recombinase were positive in 16 mice at the 3rd day and 8 mice at the third weekend after injecting Lentivirus. In group L， Luciferase was positive in 17 mice at the 3rd day and 8 mice at the third weekend after injecting Lentivirus， while Cre recombinase was negative in all. Conclusion LOXP-DsRed-LOXP system are successfully constructed. The in vivo and in vitro non-invasive detection of Cre recombinase activity and expression was achieved. By which it could evaluate the efficiency of virus infection and gene modification of colorectal mucosal basal stem cells in APCLOXP/LOXP mice. [Key words] Cre recombinase； DsRed fluorescent protein； LOXP-DsRed-LOXP system； Colorectal cancer
Cre/Loxp系统所介导的重组反应仅依赖于Cre酶及其识别位点Loxp序列，不需要消耗能量及其他辅助因子的参与，同时没有种属特异性，因而被广泛应用于基因修饰及其功能鉴定的研究中[1-3]。近年来，多项研究成功应用慢病毒载体将Cre酶引入转基因鼠的特定组织，并在特定发育时期实现了特定基因的修饰，使得Cre/Loxp系统在小鼠疾病造模应用中取得突破性进展[4-8]。如Vaish等[9]成功应用慢病毒将Cre酶引入APCCKO鼠结直肠黏膜上皮细胞构建出了结直肠癌散发性癌灶模型。然而该系统在基因修饰过程中，Loxp位点所在的染色体构型、DNA甲基化程度及Cre酶的转录活性等都将影响重组效率，同时Cre酶对处于不同类型细胞和不同发育时期染色质中Loxp位点的识别能力不同，导致Cre酶在不同物种或同一物种的不同类型细胞或组织中介导Loxp位点发生重组的效率差异较大[10-11]。因此，在利用Cre酶表达载体慢病毒感染小鼠结直肠黏膜干细胞诱发其突变构建模拟人结直肠癌散发性癌灶过程中，不仅要检测慢病毒的在体感染效率，还需检测Cre酶的转录活性。虽然前期研究可通过检测其携带的报告基因（如GFP荧光蛋白或β-半乳糖苷酶）来反映病毒在体感染效率，却忽略了Cre酶转录活性的检测[9]，且传统的Cre酶检测依赖于组织取材行Western Blot或免疫组化检测，无法实现活体内局部动态无损伤性检测。因此本研究拟通过构建LOXP-DsRed-LOXP系统来探索其在体内外检测Cre酶活性中的应用。
1 材料与方法
1.1 材料
①质粒：模板质粒pMSCV-LOXP-DsRed-LOXP-3xHA-Puro-WPRE（addgene32703），载体质粒pCMV：GFP（LOXP）lacZ（addgene 31125），包装质粒pMD2.G（addgene12259）与psPAX2（addgene12260）。②试剂：DMEM高糖培养基、Optim-MEM培养基、PBS、胎牛血清（美国GIBCO公司）、胰酶等，dNTPS、Taq聚合酶、T4 DNA连接酶、BamH Ⅰ核酸内切酶（美国NEB公司）；质粒抽提试剂盒（德国GIAGEN公司）；转染试剂Lipofectamine 2000；Cre酶（Cre Recombinase Ges？鄄icles，TAKARA公司）。③仪器设备：CO2恒温孵箱（Thermo Fisher公司），倒置荧光显微镜（日本OLYMPUS公司），PCR仪（德国Biometra Tgradient）；④动物：SPF级4周龄Balb/c雌性裸鼠20只；SPF级4周龄雌性APCLOXP/LOXP转基因小鼠40只（实验动物合格证号：4200 9800001176）。
1. 2 方法
1.2.1 逆转录病毒表达载体的构建 利用PCR方法从含有DsRed基因质粒克隆模板pMSCV-LOXP-DsRed-LOXP-3xHA-Puro-WPRE 中获取目的基因，引物：F，5′-TTCTTGGATCCATAACTTCGTATAGCATA？鄄CATTATACGAAGTTATAATTCTGCAGATATCCAGCA？鄄-3′；R，5′-TTCTTGGATCCTCGAGCGGCCTTATTCAGC？鄄TAGCTCTACTGGA-3′。产物大小为792 bp，并经Ba？鄄mH Ⅰ单酶切纯化。扩增条件为变性：95℃ 30 s；退火：64℃ 30 s；延伸：72℃ 40 s ，40个循环。后行1%琼脂糖凝胶电泳测定扩增产物。使用BamH Ⅰ核酸内切酶对逆转录病毒载体质粒pCMV：GFP（LOXP）lacZ和DsRed基因单酶切，37℃ 条件下2 h。酶切产物纯化后使用T4 DNA连接酶行DsRed基因连接反应连接入表达载体。连接完成后转化入感受态大肠埃希菌DH-5α中，37℃培养过夜后挑取平板中单克隆菌落接种于 5 mL LB（Luria-Bertani）培养基中，并加入5 μL氨苄青霉素，37℃、220 r/min摇床培养过夜，使用Qiagen质粒提取试剂盒提取质粒，随后进行酶切鉴定，将酶切鉴定正确的质粒进行测序检测。
1.2.2 逆转录病毒pCMV-LOXP-DsRed-LOXP-lacZ的包装 转染前1 d，使用2 mL无抗生素的10%DMEM培养基将5×105个293T细胞接种于六孔板中，以保证在转染时细胞的混浊度达到90%～95%。转染前2 h使用无抗生素的OPTI-MEM换液。对于每个转染样品，在250 μL无血清、无抗生素OPTI-MEM培养基中稀释上述质粒及包装质粒共4.0 μg，并轻轻混匀。轻轻混匀Lipo 2000，然后取相应的量稀释在Opti-MEM 培养基中，室温下静置5 min。混合Lipo-2000和DNA的稀释液（总体积为500 μL）。轻轻混匀并在室温下静置20 min，细胞板的每个孔中吸出500 μL培养基后，再画圈加入上述混合液500 μL，并前后轻轻摇动细胞板使混合液与孔中的培养液混匀。细胞于37℃、5%CO2培养箱中培养4～6 h后使用含5%FBS的DMEM（含抗生素）2 mL换液，并培养至转染后24～48 h收毒，用于下游实验。
1.2.3 LOXP-DsRed-LOXP系统的构建 感染前1 d将状态良好的MCA38细胞接种到六孔板，使其感染?r细胞汇合率介于50%～70%。感染前30 min，吸出细胞上清，更换为含有5 μg/mL polybrene完全培养基，同时从冰箱取出慢病毒并在冰上缓慢融化。30 min后，将适量pCMV-LOXP-DsRed-LOXP-lacZ病毒颗粒画圈加入细胞上清中，继续37℃培养。感染72 h后观察细胞荧光情况并更换培养基，加入终浓度为4 μg/mL（经梯度实验确定）嘌呤霉素（puromycin）筛选。每隔2～3 d换1次含终浓度为4 μg/mL puromycin完全培养基。待空白对照组细胞完全死亡后，扩增存活细胞，继续培养。 1.2.4 裸鼠结肠癌细胞原位移植模型构建 将SPF级4周龄雄性Balb/c裸鼠20只随机分为两组（n=10），适应1周后行结直肠黏膜下肿瘤细胞注射。MCA38Cre-Luciferase细胞与MCA38Luciferase细胞消化离心后制成单细胞悬液，计数后取适量细胞用PBS悬浮，通过小鼠结肠镜行结直肠黏膜下注射。第一组每只接种2×106个MCA38Cre-Luciferase细胞，第二组每只接种2×106个MCA38Luciferase细胞，注射体积均为15 μL。2周后行小鼠活体成像及肠镜检测成瘤情况，同时取灌肠液检测Cre酶活性及表达情况。
1.2.5 LOXP-DsRed-LOXP系统体外Cre酶活性检测 检测前1 d传代MCA38LOXP-DsRed-LOXP与MCA38DsRed至十二孔板，使其细胞密度在60%～80%。检测前去除细胞上清，更换为含6 μg/mL polybrene的完全培养基。随后每孔加入10 μL Cre酶，并将十二孔板室温条件下离心30 min，37℃孵育2 h后更换为完全培养基继续培养，48 h后观察细胞荧光变化情况。
1.2.6 LOXP-DsRed-LOXP系统体内Cre酶活性检测 检测前1 d传代MCA38LOXP-DsRed-LOXP至十二孔板，使其细胞密度在60%～80%。检测前去除细胞上清，更换为含6 μg/mL polybrene的完全培养基。随后收集裸鼠结肠癌细胞原位移植模型灌肠液，经0.45 μm滤器过滤后加入到培养孔中，并将十二孔板室温条件下离心30 min，37℃孵育2 h后更换为完全培养基继续培养，48 h后观察细胞荧光变化情况。
1.2.7 APCLOXP/LOXP小鼠慢病毒颗粒结直肠黏膜注射 将SPF级4周龄健康APCLOXP/LOXP小鼠40只随机分为两组（n=20）。病毒注射前一晚，暂停饲料供应，仅提供饮水。病毒颗粒注射前，戊巴比妥腹腔注射麻醉，随后将小鼠固定于操作台，使用小鼠结肠镜将提前冰融的病毒颗粒注射至小鼠结直肠黏膜下。其中CL组使用可表达Cre酶与荧光素酶（Luciferase）的慢病毒颗粒注射，L组使用仅表达Luciferase的慢病毒颗粒注射。
1.2.8 APCLOXP/LOXP小鼠灌肠液Cre酶活性检测 病毒注射后分别于第3天及第3周末行小鼠灌肠，收集灌肠液，0.45 μm滤器过滤后备用。检测前1 d传代MCA38LOXP-DsRed-LOXP至十二孔板，使其细胞密度在60%～80%。检测前去除细胞上清，更换为含6 μg/mL polybrene的完全培养基。随后将前述备用灌肠液加入到培养孔中，并将十二孔板室温条件下离心30 min，37℃孵育2 h后更换为完全培养基继续培养，48 h后观察细胞荧光变化情况。
1.2.9 APCLOXP/LOXP小鼠活体成像检测Luciferase表达情况 用无菌PBS将D-荧光素钠盐配制成15 mg/mL，0.2 μm滤器过滤除菌后混匀，冰冷避光保存。小鼠病毒注射后第3天及第3周末，按小鼠10 μL/g体重浓度腹腔注射相应体积的15 mg/mL D-荧光素钠盐。注射入体内10～20 min（待光信号达到最强稳定平台期）后行成像分析。
2 结果
2.1 逆转录病毒表达载体pCMV-LOXP-DsRed-LOXP-lacZ的构建与病毒包装
成功提取目的基因DsRed PCR产物；回收经BamHⅠ单酶切pCMV：GFP（LOXP）lacZ大小为8568 bp的酶切片段，纯化后得到用于构建慢病毒的表达载体。将构建好的pCMV-LOXP-DsRed-LOXP-lacZ经BamH Ⅰ单酶切，显示两条带，分别为DsRed编码区片段（792 bp）和载体片段（8568 bp），序列大小正确。测序结果显示新构建的pCMV-LOXP-DsRed-LOXP-lacZ中DsRed序列与GeneBank数据库中完全一致。成功包装LOXP-DsRed-LOXP基因过表达慢病毒颗粒，滴度测定为1×109 TU/mL。
2.2 MCA38LOXP-DsRed-LOXP荧光表达情况
pCMV-LOXP-DsRed- LOXP-lacZ病毒颗粒转染MCA38细胞并行puromycin筛选构建稳转株MCA 38LOXP-DsRed-LOXP，荧光表达情况良好（图1，封四），此细胞系成功构建。
2.3 裸鼠结肠癌细胞原位移植模型构建情况
肿瘤细胞注射2周后行肠镜检测（图2）及活体成像检测（图3），均证实结直肠癌原位移植模型成功构建。
2.4 LOXP-DsRed-LOXP系统体外Cre酶活性检测结果
Cre酶作用48 h后，观察到MCA38LOXP-DsRed-LOXP荧光显著减弱，说明LOXP-DsRed-LOXP系统可成功检测体外Cre酶活性（图4，封四）。
2.5 LOXP-DsRed-LOXP系统体内Cre酶活性检测结果
裸鼠原位移植模型MCA38Cre-Luciferase组灌肠液作用48 h后，观察到MCA38LOXP-DsRed-LOXP荧光情况减弱，MCA38Luciferase组灌肠液作用48 h后荧光增强，?f明LOXP-DsRed-LOXP系统可成功检测体内Cre酶活性。见图5，封四。
2.6 APCLOXP/LOXP小鼠灌肠液Cre酶活性检测结果
CL组APCLOXP/LOXP小鼠病毒注射后第3天出现16只小鼠灌肠液使MCA38LOXP-DsRed-LOXP出现荧光减弱，第3周末8只小鼠使MCA38LOXP-DsRed-LOXP出现荧光减弱（图6，封四）。L组APCLOXP/LOXP小鼠第3天及第3周末灌肠液均未使MCA38LOXP-DsRed-LOXP出现荧光减弱。 2.7 小鼠活体成像检测Luciferase表达情况
CL组模型鼠病毒注射后第3天检出16只小鼠荧光素酶阳性，第3周末8只小鼠荧光素酶阳性。L组模型鼠病毒注射后第3天检出17只小鼠荧光素酶阳性，第3周末检出8只小鼠荧光素酶阳性。见图7，封四。
3 讨论
在LOXP-DsRed-LOXP系统构建过程中，本研究优先选择DsRed荧光蛋白，相比于GFP，其红色荧光穿透力较强、持续时间长，且荧光强度比最好的绿色荧光蛋白GFP突变体更高[12]，同时利用Cre/LOXP系统所具有的独特性质，构建出镶嵌有LOXP序列的DsRed基因[13]。在无Cre酶存在的情况下，DsRed基因可正常转录并在MCA38细胞内表达红色荧光蛋白，当Cre酶作用于LOXP序列后，DsRed基因即被灭活，导致红色荧光蛋白无法正常表达，随后通过倒置荧光显微镜观察MCA38LOXP-DsRed-LOXP细胞荧光情况即可快速判断Cre酶活性。由于MCA38LOXP-DsRed-LOXP细胞可长期培养，且小鼠灌肠液收集方便，因此可满足长期动态监测小鼠结直肠黏膜上皮细胞Cre酶的表达情况。
据此，在体外应用纯化的Cre酶作用于MCA38 LOXP-DsRed-LOXP细胞48 h后，红色荧光明显减弱，说明该系统可体外有效检测Cre酶活性。为了进一步探索该系统能否检测机体内所产生的Cre酶活性，同时构建了裸鼠结肠癌细胞原位移植模型，并于肿瘤细胞种植后第2周末（此时可通过小鼠结肠镜检测判断肿瘤生长情?r）收集其灌肠液作用于MCA38LOXP-DsRed-LOXP细胞，结果MCA38Cre-Luciferase组，红色荧光减弱明显，说明该系统可成功检测体内Cre酶活性及表达情况。随后，在使用可表达Cre酶及luciferase的CL组与仅表达luciferase的L组感染APCLOXP/LOXP小鼠结直肠黏膜干细胞诱发其突变构建模拟人结直肠癌散发性癌灶模型中，分别于病毒注射后第3天及第3周末收集灌肠液作用于MCA38LOXP-DsRed-LOXP细胞，结果CL组分别有16只与8只小鼠于病毒注射后第3天及第3周末成功检测到灌肠液中Cre酶的表达及其活性，且Cre酶与Luciferase检测结果一致，即Cre酶阳性鼠其Luci？鄄ferase也为阳性。另外L组始终未检测到Cre酶的表达，仅于病毒注射后第3天及第3周末分别检测到17只与8只小鼠出现Luciferase阳性。
上述结果说明本研究成功构建出了LOXP-DsRed-LOXP系统，且在小鼠结直肠癌造模过程中通过收集灌肠液可有效判定结直肠黏膜上皮细胞Cre酶的活性及其表达情况。但为了保证结直肠黏膜干细胞中APC基因被成功修饰，还需明确干细胞中Cre酶的转录活性及其表达情况。由于小鼠结肠上皮为一单层细胞，该细胞每3～5天更新1次，这种更新由结肠隐窝基底部的多功能干细胞维持[14-16]。因此在病毒注射后第3周末收集灌肠液检测Cre酶活性可明确Cre酶基因是否成功整合到干细胞中并稳定表达。只有干细胞稳定表达Cre酶并成功修饰APC基因诱发干细胞突变后，其自我更新、克隆、增殖分化，超过了正常肠上皮组织细胞灭活的速度，才将导致腺瘤形成[17-20]。本研究提示Cre酶基因成功整合到这批小鼠的结直肠黏膜干细胞中。为了进一步明确干细胞中APC基因的修饰情况，需后期对组织取材行目的蛋白检测。但在实验进展过程中，发现早期Cre酶的阳性率与后期APC蛋白检出率呈正相关。说明早期检测Cre酶对靶基因修饰成功情况具有预判作用，也能根据Cre酶的检测情况，及时优化实验方案，减少实验耗材的浪费。
本研究所构建的LOXP-DsRed-LOXP系统除上述用途以外，在构建表达Cre酶的稳转细胞株时，同样可利用该系统及时检测稳转株Cre酶的表达情况，而不必通过WB或免疫组化检测Cre酶的表达，节约了时间与精力，同时还可间接判断含有Cre酶基因的慢病毒体外感染目的细胞的感染效率。此外，该系统还可用来检测泌尿系统肿瘤及生殖系统肿瘤造模过程中的病毒感染情况。但仍局限于特殊部位慢病毒感染情况的检测，对于其他部位的实体瘤造模有一定局限，因此有待于进一步探索更好的方法应用于其他疾病模型鼠构建过程中慢病毒感染效率的检测。
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（收稿日期：2017-08-25 本文编辑：李岳泽）
发表于 2018-8-17 09:07:10