2018滇重楼预处理对脓毒症大鼠的肠道功能保护及小肠HMGB1表达的影响

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　　摘要：目的构建脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）诱导脓毒症（sepsis）大鼠早期肠损伤模型，给予不同浓度滇重楼（Rhizoma Paridis of yunnan）灌胃预处理，探讨滇重楼对脓毒症大鼠的肠道功能保护及小肠高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）表达的影响。方法清洁级成年SD大鼠雌性80只，随机分为5组，16只/组，对照组、模型组、低剂量组（20mg/kg.po）、中等剂量组（40mg/kg.po）、高剂量组（80mg/kg.po）。给予滇重楼预处理后，构建脓毒症大鼠模型（LPS 1mg/kg.iv），于24h取材，检测血中白细胞数（WBC）、谷丙转氨酶（ALT）、肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）、肌酐（Cre）、乳酸（Lac）的含量，行小肠病理检查并组织学评分，采用ELISA法检测血浆中二胺氧化酶（DAO）和D乳酸（D-Lac）的含量，分别采用WesternBlot和Q-PCR检测小肠中HMGB1的蛋白及mRNA表达水平。结果模型组大鼠与对照组比较全血中ALT、CK-MB、Cre、Lac含量升高，WBC含量下降，有统计学意义（PⅢ级百分比升高，有统计学意义（P0.05）。模型组血浆中DAO和D-Lac含量高于对照组，而滇重楼治疗组低于模型组，差异有统计学意义（P http://
　　关键词：脓毒症；滇重楼；肠道功能保护；高迁移率族蛋白B1
　　中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1007-2349（2017）11-0071-04脓毒症（sepsis）是重症医学科危重患者常见死因之一，患病率约为人口3‰，病死率高达20.3%～29.9%[1]，是机体对感染的反应失调而导致危及生命的器官功能障碍[2]，也是严重创伤、休克、感染、外科手术等常见并发症。目前，脓毒症的发病机制尚不完全明确，而肠道细菌及内毒素移位导致的肠黏膜屏障功能障碍是其主要机制之一，也是脓毒症发生的始动环节，可诱发失控性全身炎症反应综合征（systematic inflammatory response syndrome，SIRS）致多器官功能障碍综合征（Multiple organ dysfunction syndrome，MODS），常表现为肠道功能紊乱发生最早及恢复最迟。高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）是一种高度保守的非组DNA结合蛋白，可诱导RAGE、TLR2/4、NF-κB等炎症因子释放导致多器官靶细胞损伤，作为一种晚期炎症因子在脓毒症的发生发展中起重要作用[3-5]。
　　据报道，滇重楼多种成分具有抗炎作用，临床可用于器官保护、抗病原微生物、抗蛇虫毒及治疗免疫系统和妇产科疾病[6]。笔者前期研究，利用脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）15mg/kg腹腔注构建大鼠肠黏膜功能障碍模型，滇重楼连续灌胃提示其肠黏膜抗炎保护作用。但结合临床实践经验，脓毒症炎症因子瀑布样级联释放常使疾病迅速向MODS难逆转性转变，如何在SIRS早期通过抑制炎症因子释放成为干预疾病转归的重点。本课题拟通过LPS 1mg/kg股静脉注射构建脓毒症大鼠早期肠损伤模型，探讨滇重楼预处理对脓毒症大鼠的肠道功能保护及小肠HMGB1表达的影响。
　　1材料与方法
　　1.1材料清洁级健康成年SD大鼠雌性80只，体重（200±10）g，由解放军昆明总医院科研实验中心提供（实验动物质量合格证号：SYXK（滇）2016-2017）。滇重楼由昆明医科大学第四附属医院药剂科提供。脂多糖购于美国Sigma公司；血浆二胺氧化酶（DAO）和D乳酸（D-Lac）ELISA试剂盒购于武汉华美公司；HMGB1一抗、二抗购于abmart公司；Trizol Reagent 试剂盒购于Lifetech公司；RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒购于Fermentas公司。
　　1.2方法
　　1.2.1实?动物分组实验采用成组设计，清洁级健康SD大鼠雌性80只，随机分为5组，对照组、模型组、低剂量组、中等剂量组、高剂量组，每组16只。将滇重楼颗粒用生理盐水制成混悬液灌胃预处理，剂量按照成人剂量的5倍、10倍、20倍，分别对应低剂量组（20 mg/kg）、中等剂量组（40 mg/kg）、高剂量组（80 mg/kg），对照组及模型组给予相同剂量生理盐水。除对照组经股静脉予以相同剂量生理盐水外，其余组经股静脉予以LPS 1 mg/kg.iv。灌胃前禁食禁饮2 h，灌胃后正常饮食，密切观察大鼠排便进食、呼吸心跳、精神状态等变化，于24 h取材分别进行检测。
　　1.2.2实验室指标检测腹腔注射水合氯醛0.4 g/kg麻醉大鼠，迅速开腹经腹主动脉采集动脉血，分别检测各组动物白细胞数（WBC）、谷丙转氨酶（ALT）、肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）、肌酐（Cre）、乳酸（Lac）观察模型成立及脏器功能变化情况。
　　1.2.3存活率及病理组织学评分观察24 h内脓毒症大鼠存活率。分别取各组大鼠小肠用10%多聚甲醛固定24 h，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、常规切片和苏木素-伊红染色后，封片镜检，并对小肠切片病理组织学评分[7]：0级，黏膜无明显炎症；I级，黏膜有明显水肿，黏膜下及肌层内轻度白细胞浸润；II级，黏膜明显水肿，黏膜下及肌层内白细胞浸润增多；III级，黏膜部分缺失，腺体部分不完整，白细胞聚集；IV级，黏膜广泛破坏，腺体多数不完整，溃疡形成，肉芽组织形成，组织结构明显破坏。   　　1.2.4ELISA法检测DAO和D-Lac水平分别取各组大鼠全血离心制成血浆，按每孔100ul分别加标准品或待测样本，37℃温育，依次加生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液、底物溶液、终止溶液，终止反应后5min内用酶标仪在450nm波长依次测量各孔OD值，分别对照DAO和D-Lac标准品进行统计分析。
　　1.2.5WesternBlot法检测小肠HMGB1水平分别取小肠标本制成检测标本，在样品中等体积2×上样缓冲液，按每孔100 ug蛋白上样液。配10% SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，转印，恒流转膜，5% 脱脂牛奶封闭，室温，摇床上摇2 h，加β-actin一抗，1：1000，4℃，过夜；TBST漂洗，加入HRP标记通用型二抗（goat来源），孵育1 h，TBST漂洗，成像。扫描条带，并用Image J进行分析。
　　1.2.6Q-PCR检测小肠mRNA水平采用Trizol法分别提取小肠组织的总RNA，逆转录获得cDNA，Q-PCR仪扩增（按说明书操作）。大鼠HMGB1上游引物5’-TTCTTCTTGTTCTGTTCTGAG-3’，下游引物5’-CTTCGCAACATCACCAAT-3’，PCR产物大小219 bp；内参照β-actin上游引物5’-CGAGAAGATGACCCAGAT-3’，下游引物5’-GATAGCACAGCCTGGATA-3’。软件自行得出△Ct、△△Ct、2-△△Ct值，由溶解曲线判断扩增产物的特异性。
　　1.3统计学处理
　　使用SPSS 21.0统计软件进行统计学处理。全部数据均用均数±标准差（x±s）表示，P0.05无统计学意义。各实验组的组间及组内均采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）对资料进行统计处理。率的比较用完全随机设计资料χ2检验，P0.05提示两个率之间差异无统计学意义。
　　2结果
　　2.1生化指标检测结果模型组大鼠与对照组比较全血中ALT、CK-MB、Cre、Lac含量升高，WBC含量下降，差异均有统计学意义（P0.05）。见表1。
　　2.2脓毒症大鼠存活率及病理组织学评分结果模型组与对照组比较大鼠存活率下降，病理组织学评分>Ⅲ级百分比升高，差异均有统计学意义（PⅢ级百分比下降，差异均有统计学意义（P60%，符合脓毒症模型指标。但治疗组ALT和Cre与模型组差异无统计学意义（P>0.05），可能与滇重楼的肝肾毒性有关。经滇重楼预处理的治疗组与模型组比较，血浆中DAO和D-Lac降低，小肠病理组织学评分>Ⅲ级百分比下降，差异均有统计学意义（P  　　参考文献：
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