2018“身份指纹”让早期肝癌无所遁形

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　　这种新方法能将肝癌的漏诊率降低一半以上，帮助医生发现更多的早期肝癌患者。
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　　近日，国际顶尖学术杂志《Nature Materials》上一篇关于肝癌早诊早治的文章一经发表，即引起国内外科学界的广泛关注。中山大学肿瘤防治中心主任徐瑞华教授，与美国加州大学圣迭戈分校的张康教授，一同带领中美科学家团队，经反复探求，终于破解了一项众多科学家想攻克的世界性难题――通过检测少量血液中循环肿瘤DNA（ctDNA）特定位点甲基化水平，对肝癌进行早期诊断及疗效和预后预测的新方法。
　　记者了解到，这种新方法与原来常规的甲胎蛋白检测相比，将肝癌的漏诊率降低一半以上，能帮助医生发现更多的早期肝癌患者。
　　《Nature Materials》是一本对论文要求近于苛刻的学术刊物，每年发表论文仅170篇左右，影响因子高达39.737。所选择的审稿人也是相关研究领域的权威或著名学者，以严谨细致著称。审稿专家给出了这样的总结：“（该研究意味着）肿瘤的液体活检技术将迎来一个全新的时代”。
　　100位肝癌患者中有40位漏诊
　　肝癌被称为癌中之王。2015年的统计资料表明，全世界每年肝癌新发和死亡病例分别为78.3万和74.6万。其中，我国肝癌新发病例和死亡病例分别高达46.6万和42.2万，分别居所有恶性肿瘤第四和第三位，均占世界肝癌新发病例和死亡病例的50%以上，造成的生命损失和公共卫生负担可谓触目惊心。
　　徐瑞华教授介绍说，肝癌起病隐匿，患者一旦出现临床症状，病情往往已经处于中晚期，失去了根治性治疗的机会，预后极其凶险。早期肝癌5年生存率为50%～70%，中期5年生存率为25%～30%，晚期5年生存率为10%～15%，末期5年生存率为0%。“也就是说，整体5年生存率是仍不足15%。而早期获得诊断的肝癌患者，在经过有效治疗后，5年生存率可达到50%以上。”
　　现有的肝癌标志物甲胎蛋白AFP虽然在部分患者血液中可检测到明显的升高（超过20ng/ml），但其敏感性只有60%左右。这就意味着，如果仅依赖AFP作为早期诊断标志物，100位肝癌患者中将有40位漏诊。
　　在临床上目睹太多中晚期肝癌患者家庭痛失亲人的悲剧，徐瑞华教授团队一直都在血液中寻找合适的肝癌早期诊断标志物。在经过无数个日夜艰苦的探求之后，2017年10月，徐瑞华教授与张康教授带领的中美科学家团队，终于研究出通过检测少量血液中ctDNA特定位点甲基化水平，对肝癌进行早期诊断及疗效和预后预测的新方法。
　　肝癌“身份指纹”被科学家破获
　　徐瑞华教授形象地说，ctDNA相当于肿瘤细胞释放到血液中的“身份指纹”，由于其携带有与原发肿瘤相一致的甲基化改变，理论上可以利用ctDNA的甲基化谱对肿瘤进行诊断。这一被称为液体活检的新技术已经成为当前肿瘤研究领域的热点之一。但是，ctDNA在血液中的含量极微小，每毫升血中仅有约20ng，相当于一滴水的一亿分之一，并且混杂在更大量的正常游离DNA背景中。在这么微量的ctDNA中检测单个碱基的甲基化水平，好比在机场和火车站的数百万人流中找到个别犯罪分子，其难度可想而知。
　　经过艰苦的探索，研究团队先后攻克了稳定提取微量ctDNA、提高重亚硫酸盐转化效率、靶向甲基化PCR扩增及测序、海量数据的统计学分析处理等一个个技术壁垒，终于从40多万个候选位点中，分别寻找到10个早期诊断和疗效相关以及8个预后相关的位点。这就像是破获了肝癌的“身份指纹”，让即使是很早期的肝癌病灶也无所遁形。
　　可喜的是，这10个早期诊断位点的甲基化水平在总共1098例肝癌患者和835例健康人的研究人群中，显示出高达84.8%的诊断敏感性和93.1%的特异性，还能准确地预测肿瘤的分期、疗效和复发。
　　徐瑞华教授分析说，这意味着利用这一方法，肝癌患者的漏诊率将比AFP降低一半以上，早期肝癌患者及时确诊以后，将更有机会接受根治性治疗，其预后将得到极大的改善。而利用8个预后相关位点的甲基化水平，能准确预测不同患者的生存和预后，有利于指导医生对不同患者进行更为个体化的精准治疗。例如对预后不佳者，应避免给予过度治疗，而对复发高危患者，则给予更为积极的辅助治疗等。
　　抽取几毫升血液即可完成检测
　　这一新方法与传统的肝癌诊断技术相比具有明显的优越性。
　　首先是简便快速。仅需抽取几毫升血液即可完成检测，患者可避免活检创伤和放射性辐射。
　　其次是诊断敏感性和特异性更高，误诊和漏诊率大大降低。单纯依靠AFP检测，只能发现60%左右真正的肝癌患者；AFP对肝癌的诊断特异性在80%左右，也就是说其对肝癌的误诊率为20%。而甲基化标志物对肝癌的诊断敏感性为84.9%，特异性为93.1%。这意味着，新方法的漏?\率降至15%左右，而误诊率更是降至7%左右。
　　再次，可以实时监测肿瘤的疗效，并早于常规影像学检查数周乃至数月发现肿瘤的复发。
　　最后是经济性，尤其是在大规模肝癌筛查中的应用，能够节约大量宝贵的医疗资源。
　　利于开展肝癌个体化精准治疗
　　目前，肝癌ctDNA甲基化诊断试剂盒的研发已经取得实质性进展，已于10月中旬首先在中山大学肿瘤防治中心应用，预计很快就能够大规模生产，年供应100万人份的试剂盒。检测对象重点是具有肝癌高危因素，如既往有肝炎肝硬化病史、肝癌家族史，或既往罹患肝癌接受了手术等治疗的人群，进一步会推广到进行常规防癌体检的人群。
　　这一成果的进一步转化推广，将极大提高肝癌早期诊断的准确率，并有利于开展更为个体化的精准治疗，对于提高肝癌患者的整体疗效具有重大意义。   　　徐瑞华教授表示，他的团队将继续研究ctDNA甲基化标志物在结直肠癌、胃癌、肺癌、乳腺癌等其他严重威胁人们健康的常见肿瘤中的应用，力求为这些肿瘤的筛查、诊断、疗效监测与预后预测提供新的有效手段，造福更多肿瘤患者。
　　Q&A
　　问：为什么ctDNA的甲基化更适宜作为早期诊断和预后预测的标志物，而非基因突变？
　　答：有这么几个原因。首先大多数肿瘤缺乏明显的驱动基因突变。从美国的肿瘤基因图谱计划（TCGA）可以看出，肿瘤患者的基因突变非常个体化，而罹患同一肿瘤的不同患者，其DNA的甲基化改变相对稳定和一致。
　　其次，ctDNA在血液中含量很低，对于突变频率较低的基因位点，需要极深的测序深度才能检测到，成本高昂。而在200bp～300bp左右的ctDNA片段中，可存在多个可能发生甲基化改变的CpG位点，相对低频率的基因突变更容易检出。
　　最后，ctDNA甲基化变化往往发生在体细胞基因突变之前，是肿瘤发生的早期分子事件，因此更利于早期诊断。
　　问：科学家们为什么要选择甲基化来诊断早期肝癌？是基于哪些特征？
　　答：DNA甲基化是一种表观遗传的修饰，是指不需要改变核苷酸序列的基因表达可遗传改变。其特征是可逆性、可遗传性，以及DNA的序列未发生改变。异常的DNA甲基化会导致基因的表达异常，从而促进癌症的发生。DNA甲基化是肿瘤发生中的早期事件，早于基因突变从而更有利于早期诊断。
　　此外，甲基化特异的PCR 技术的出现，使得DNA甲基化水平的检测变得十分方便。DNA甲基化检测稳定性好，有组织特异性，易于检测且其异常程度常与癌症的进展相关。因此，我们选择了它。
　　问：目前靶向治疗已经成为肝癌治疗方向之一，下一步有无可能通过检测ctDNA中的特定位点甲基化水平，预测患者对靶向药物的疗效？
　　答：这是我们下一步的研究计划之一，但目前临床上接受靶向治疗的肝癌患者还不是很多，ctDNA甲基化标志物的筛选需要一定数量的受试者样本，才有可能通过统计学分析发现具有疗效预测价值的甲基化位点。我们已经开始着手收集这一类患者的标本，希望能在积累到一定数量以后，寻找到这样的甲基化标志物。此外，由于与基因的突变不同，表观遗传学的改变大都是可逆的。因此，利用药物来改变细胞DNA的甲基化改变本身就可能成为治疗肝癌的一条新途径。
　　问：目前是否已有病人通过你们的方法发现肝癌？
　　答：我们的正常?φ帐鞘杖〗?行健康体检的人群的标本，我们前后检测了大约5000例人群的标本，其中有4例～5例是明显增高的，然后追踪患者情况，最后明确诊断为肝癌。另有10多例在可疑范围内，正在密切随访当中。这也是我们下一步要做的工作，即进行前瞻性的大规模筛查研究，希望能通过我们的新方法，进一步提高筛查的效价比，同时减少筛查成本，节约医疗资源。
　　问：既然这是一项国际国内众多科学家都想攻克的世界性难题，那么您的研究取得成功的关键因素有哪些呢？
　　答：首先是我们坚持以科学问题为导向，密切结合临床实践需要和我国国情，着眼于国际最新研究方向，找到了这么一个尖端的研究思路。其次是我们掌握了一系列关键性的实验技术。再次，作为华南地区最大、最顶尖的肿瘤中心，我们具有丰富的肝癌病例来源，而科学完善的随访制度和信息系统，能保证患者的临床资料和生存随访数据真实可信。最后，我们拥有一个跨学科、跨国界的研究团队，包括临床医生、基础医学研究人员、生物信息学专家等，为我们的研究取得突破打下了坚实的基础。
　　链接：现有的肝癌诊断和筛查方法
　　原发性肝癌诊断
　　原发性肝癌病理学诊断标准：
　　肝脏占位病灶或者肝外转移灶活检或手术切除组织标本，经病理组织学和/或细胞学检查诊断为HCC，此为金标准。
　　原发性肝癌临床诊断标准：
　　1.具有肝硬化以及HBV和/或HCV感染的证据。
　　2.血清AFP≥400μg/L持续1个月或≥200μg/L持续2个月，并能排除其他原因引起的AFP升高。
　　3.典型的HCC影像学特征：同期多排CT扫描和/或动态对比增强MRI检查显示肝脏占位在动脉期快速不均质血管强化，而静脉期或延迟期快速洗脱。
　　1）如果肝脏占位直径为1cm～2cm，则需要CT和MRI两项影像学检查都显示肝脏占位具有上述肝癌的特征，方可诊断。
　　2）如果肝脏占位直径≥2cm，CT和MRI两项影像学检查中有一项显示肝脏占位具有上述肝癌的特征，即可诊断。
　　原发性肝癌的筛查
　　常规监测筛查指标主要包括AFP和肝脏超声检查（US）。
　　对于≥40岁的男性或≥50岁女性，具有HBV和/或HCV感染，嗜酒、合并糖尿病以及有肝癌家族史的高危人群，一般是每隔6个月进行一次检查。由于AFP的敏感性和特异度不高，2010版美国肝病研究学会指南已不再将AFP作为筛查指标，超声检查对于大于20mm的结节，诊断符合率为84%，而对于肝内5mm～20mm的结节，超声的敏感性只有33%。