2018大孔吸附树脂分离纯化苗药雪人参中α―葡萄糖苷酶抑制物质的研究

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　　【摘要】目的：筛选出纯化苗药雪人参中α-葡萄糖苷酶抑制物质的最佳大孔树脂，并对影响分离纯化的主要因素进行探讨，确定最优工艺参数。方法：采用分光光度法和酶标法测定雪人参乙醇提取液中α-葡萄糖苷酶抑制物质的含量，并通过静态吸附和动态吸附两种方法筛选出最佳大孔树脂，以α-葡萄糖苷酶抑制物质酶活性抑制率为指标对优化后的工艺条件进行验证。结果：大孔树脂HPD600在室温下吸附效果最好，优化后的工艺参数为提取液pH=80、提取液体积与大孔树脂质量之比为1∶[KG-*3/5]10，洗脱剂为70%乙醇溶液，洗脱体积为3BV。结论：纯化前后α-葡萄糖苷酶抑制物质酶活性抑制率提高约3倍，工艺稳定。
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　　【关键词】雪人参；大孔吸附树脂；α-葡萄糖苷酶抑制物质
　　【中图分类号】R2842【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）18-0017-04
　　近年来，糖尿病发病率逐年增大，已成为继肿瘤和心脑血管疾病后的第三大慢性疾病，因此侧重长期治疗且措施个体化，以达到控制病情、防止或减少并发症的目的[1]。而传统降糖药物对血糖的控制并不理想[2]。临床研究表明，α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类新型口服降糖药物[3]，可以缓解高胰岛素血症和防治餐后高血糖症，还可以减少血糖波动对机体器官的损伤，提高糖耐量，具有非常广阔的应用前景。近年开发的伏格列波糖和米格列醇等作为治疗Ⅱ型糖尿病的首选药和Ⅰ型糖尿病的辅助药物已广泛应用于临床。
　　[JP+1]雪人参（Radix Indigofera）为豆科木蓝属植物茸毛木蓝的根，又名铁刷子、血人参、红苦刺和山红花，主要分布于云南、贵州、广西等地，具有抗氧化[4]、补虚活血、降血糖及调经舒筋等功效，在贵州苗族地区，药用历史悠久。其化学成分研究表明，其富含黄酮类、萜类、酚类等化合物[5-7]。李园园等[8]报道雪人参乙醇提取物具有α-葡萄糖苷酶抑制作用，但尚未见对雪人参乙醇提取物经大孔树脂纯化后对α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究。本实验探讨了大孔树脂分离纯化雪人参中α-葡萄糖苷酶抑制物质的工艺条件，为α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备及应用提供新思路。[JP]
　　1仪器与材料
　　11仪器Multiskan MK3酶标仪（美国Thermo Electron公司）；SP-75PC型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；FW-177型中草药粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）；BSA224S-CW型电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；TGL-16G高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；HH系列数显恒温水浴锅（金坛市科析仪器有限公司）；PH-618型酸度计（上海仪电科学仪器有限公司）；96微孔酶标板，各型号微量进样器。
　　12材料雪人参采集于贵州省都匀市周边，用中草药粉碎机粉碎，过20～60目标准筛。4-硝基苯基α-D-吡喃葡萄糖苷（4-N-trophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG，美国Sigma公司）；α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，美国Sigma公司）；阿卡波糖（Acarbose，德国Serva公司）；二甲基亚砜（DMSO，美国Sigma公司），无水乙醇等均为分析纯试剂。
　　2方法
　　[JP3]21大孔树脂的预处理将D101、AB-8、HPD600、HPD100、X-5五种大孔树脂用95%乙醇浸泡24h后，用95%乙醇淋洗至流出液不浑浊为止，然后用蒸馏水洗至无醇，备用。[JP]
　　22雪人参中α-葡萄糖苷酶抑制物质的提取称取雪人参粉末100g，加入一定量60%乙醇溶液，回流提取3次，每次2h，合并提取液，离心，上清液减压蒸干，用20%二甲基亚砜溶液溶解后定容到1000mL容量瓶中，备用。
　　23大孔树脂的筛选分别称取5g上述5种大孔树脂于100mL锥形瓶中，加入80mL雪人参乙醇提取液（质量浓度为2252mg/mL，下同），常温下在振荡器上提取2h，静止24h后，离心分离，以α-葡萄糖苷酶抑制物质酶活性抑制率（简称酶活性抑制率）为指标，测定上清液中α-葡萄糖苷酶抑制物质的含量。酶活性抑制率越小，表明上清液中α-葡萄糖苷酶抑制物质的含量越低，则该树脂的吸附性能就越好[9]。
　　24α-葡萄糖苷酶抑制物质活性测定[10]在96微孔酶标板上，加入112μL磷酸钾缓冲液（pH=68），8μL上述上清液和20μL 01U/mL α-葡萄糖苷酶，混合均匀后，于37℃恒温箱中孵育30min，再加入20μL 40mmol/L PNPG开启反应，置于37℃恒温箱中反应30min，最后加入80μL 02mol/L Na2CO3溶液终止反应，于405nm处测其OD值，根据下式计算出上清液中酶活性抑制率（用Y表示），A0表示空白对照组OD值（不加样液），Aj表示样品组OD值，由于雪人参乙醇提取液本身就有颜色，因此需要测定其背景吸收，并对测定结果进行校正。
　　Y=「（Ao-Ai）/A0」×100%
　　25静态吸附
　　251吸附时间准确称取5g HPD600大孔树脂置于100mL锥形瓶中，加入80mL雪人参乙醇提取液，常温下振荡2h，静态吸附不同时间，离心，测定上清液中α-葡萄糖苷酶抑制物质的含量，根据上述公式计算酶活性抑制率。
　　252吸附温度和树脂质量分别称取不同质量的HPD600大孔树脂置于100mL锥形瓶中，加入提取液80mL，在15、20、25、30、35、40、50℃下振荡2h，静态吸附24h，离心，测定上清液中α-葡萄糖苷酶抑制物质的含量，根据上述公式计算酶活性抑制率。
　　26动态吸附分别称取5g上述5种树脂，装入30mm×300mm层析柱中，80mL提取液冲洗该柱，流速控制在2-3 BV/h，收集流出液，先用2BV去离子水冲洗层析柱，再用3BV 70%乙醇溶液洗脱，并收集流出液，减压蒸干后，用20%二甲基亚砜溶解，定容至50mL，测定α-葡萄糖苷酶抑制物质的含量，根据上述公式计算酶活性抑制率。