2018亚低温通过上调海马HSP27表达抑制红藻氨酸的致癫痫作用

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　　摘要：目的：观察亚低温治疗对癫痫持续状态（SE）大鼠海马HSP27表达的影响，以探讨亚低温治疗的神经保护机制。方法：采用侧脑室内注射红藻氨酸（KA）建立SE模型，108只雄性SD大鼠随机均分为正常对照组（N组）、假手术组（F组）、SE模型组（SE组）、亚低温治疗组（MT组），根据大鼠处死时间再分为6，12和24h共3个亚组。采用HE染色观察海马组织神经细胞变化，用免疫组化法检测海马组织中HSP27的表达。结果：MT组大鼠癫痫发作级别及神经元损害较SE组降低；SE组3个亚组HSP27表达较F组相对应的各亚组明显增多（P http://
　　关键词：亚低温；红藻氨酸；癫痫持续状态；HSP27
　　中图分类号：R742.1
　　文献标志码：A
　　文章编号：1008-2409（2015）01-0001-05
　　癫痫持续状态是指癫痫连续发作的间歇期之间意识尚未完全恢复又频繁再发，或者癫痫发作持续时间大于30min，不能自行停止。SE可导致脑损伤，以海马神经元损伤最明显，其病理机制十分复杂。癫痫脑损伤既是癫痫发作的结果，又是癫痫频发和难治，以及致残的原因，对癫痫后脑损伤和脑保护的研究具有重要的理论价值和临床意义。亚低温技术是一种非创伤性脑保护治疗措施。将体温控制在28.0～35.0℃之间称为亚低温（mildhypothermia），目前，相关基础和l临床研究大多数选择鼠温在32.0～34.0℃之间。亚低温对缺血性脑损伤的神经保护作用已得到证实，但亚低温与癫痫的相关性研究较少。热休克蛋白27（heat-shockprotein 27，HSP27）作为癫痫持续状态时海马的一个高度敏感和特定标志物，在癫痫持续状态中，HSP27表达上调具有神经元保护作用，但亚低温作用与机制尚未明确。笔者采用侧脑室注射红藻氨酸（kainic acid，KA）构建大鼠SE模型，观察亚低温治疗对癫痫持续状态的效应及其与HSP27表达的关系，以探讨亚低温的神经保护机制，为亚低温技术应用于SE治疗提供理论依据。
　　1材料与方法
　　1.1实验材料和动物及其分组
　　红藻氨酸（KA，分子式为C10H15NO4）（美国Sigma公司）；苏木素-伊红，兔抗大鼠HSP27蛋白质多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；快捷型酶标羊抗兔IgG聚合物，DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。实验动物购自桂林医学院动物实验中心，4～6周雄性SD大鼠108只，体重（280±20）g。健康实验动物在标准环境（常温下自由进食、饮水）适应性饲养7d后，依照随机数字表法分为4组（n=27）：正常组（N组）、假手术组（F组）、SE模型组（SE组）、SE模型+亚低温治疗组（MT组）。每组根据大鼠造模后处死时间点再分为6，12，24h共3个观察亚组（n=9）。
　　1.2实验方法
　　1.2.1癫痫持续状态模型制作 用10%的水合氯醛按3.6ml/kg对SD大鼠行腹腔麻醉，待麻醉成功后将大鼠固定在立体定向仪上，然后，进行备皮、消毒，沿双眼连线正中切开一长约2cm的切口，暴露出前囟门，按照大鼠脑立体定向图谱，定位于右侧侧脑室（前囟后1.0mm，旁开2.0mm及硬膜下4.0mm）。用实验动物电钻钻孔至硬脑膜，将装有KA溶液的微量进样器沿钻孔进针，深度达4.5mm时停留，注入1.0μg/μlkA溶液1.0μl，缓慢匀速地在10min左右注射完毕，留针5min左右取出微量进样器。最后用骨蜡封闭进针颅孔，消毒并缝合头皮，放回笼中开始计时，观察记录动物行为变化。以癫痫发作持续时间≥30min视为造模成功。假手术组以生理盐水代替KA溶液行侧脑室微量注射。
　　1.2.2亚低温处理 将电子温度计探头插入SD大鼠肛门内5.0cm左右，以深部肛温代表脑部温度，通过温度调节箱，使大鼠深部肛温在5～10min内降至33.0℃左右，全程将温度控制在（33.0±1.0）℃之间，持续2h，亚低温处理结束后将大鼠置于常温下（20.0～25.0℃）自然复温。
　　1.3大鼠行为学观察
　　按照Racine分级法，将大鼠癫痫持续发作的行为学表现分为6级：0级：正常，无抽搐发作；Ⅰ级：前肢和/或尾部抽动；Ⅱ级：重复转动或头部摆动；Ⅲ级：肢体出现阵挛伴站立、跌倒；Ⅳ级：连续出现全身性阵挛，伴站立、跌倒；Ⅴ级：四肢以及身体严重强直阵挛发作。SE造模后，开始观察并记录大鼠出现癫痫持续状态发作的潜伏期、发作后2h内大鼠的行为变化和癫痫发作级别。轻型发作：Ⅰ～Ⅲ级；重型发作：Ⅳ～Ⅴ级。观察时间点为6，12和24h，如SE造模未成功，则以同等标准的大鼠补充造模。
　　1.4标本制备
　　癫痫持续状态造模成功后，在6，12和24h观察时间点各取大鼠9只，用10%水合氯醛（3.6ml/kg）腹腔麻醉，仰卧固定于解剖板，沿剑突剪开胸腔并暴露心脏，将穿刺针由心尖插入升主动脉，打开输液器开关，同时剪开右心耳进行放血，接着向心脏内快速推注生理盐水250ml左右，待冲洗至流出液清亮后，向心脏内快速灌注4%多聚甲醛（pH 7.40）400ml左右，观察到大鼠四肢以及头尾部变为僵硬、强直。此时立即剪断头部，快速剥离出海马，置入4%多聚甲醛（4℃，pH 7.40）中固定24h。将海马组织常规脱水、透明、浸蜡、包埋制成蜡块，用于HE染色、免疫组化检测。
　　1.5HE染色
　　取蜡块制成石蜡切片，行HE染色，在显微镜下观察大鼠海马神经元的形态学改变。   　　1.6免疫组化染色
　　取蜡块标本，每个标本随机取5张切片，进行免疫组化法染色，显微镜下观察大鼠右侧海马CA1区HSP27免疫反应阳性神经元。阳性细胞标准：细胞核内出现黄色或棕色的颗粒物质。阳性细胞计量方法：显微镜下随机计量5个高倍视野（×400）阳性细胞数，取其平均值。
　　1.7统计学分析
　　采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。4个观察组间以及3个亚组间HSP27表达量以均数±标准差（x±s）表示，各组间数据行单因素方差分析，各组间两样本比较行q检验。P