2018天津医科大学总医院性病门诊患者生殖支原体的检测

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　　【第一作者简介】王 双（1975-），女，河北沧州人，主治医师，硕士，主要研究方向为性传播疾病及化妆品皮炎的防治。
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　　【摘 要】 目的:建立聚合酶链反应技术(PCR)检测天津医科大学总医院性病门诊患者的分泌物标本中的Mg-DNA，以了解生殖支原体感染在此性病门诊患者中的发病情况。方法：采用PCR法对泌尿生殖道分泌物标本进行检测，并同时采用了两对不同的引物同时进行检测。结果：共有8例患者生殖支原体阳性，其阳性率为3.57%。结论：天津医科大学性病门诊患者中存在生殖支原体的感染，但阳性率较低。
　　【关键词】 生殖支原体； 聚合酶链反应
　　
　　生殖支原体(mycoplasma genitalium，Mg)是Tully于1981年首次从2例非淋球菌性尿道炎病人的分泌物中分离到的病原微生物，它与人类的尿道炎、宫颈炎或盆腔感染密切相关[1]。我国对Mg的研究起步晚，对其了解还很少。我国的广州、南京、辽宁等地区有学者对不同人群的Mg感染情况进行了检测，但华北地区对此研究较少，特别是天津地区还无人对Mg进行检测和研究。
　　本实验用PCR法对性病门诊患者的分泌物标本进行了Mg-DNA的检测，并对两对引物检测的结果进行了比较，从而保证结果的可靠性，这为了解Mg在天津地区高危人群中的感染情况、Mg在性传播疾病中的作用提供了参考依据。
　　
　　1材料和方法
　　
　　1.1菌株
　　Mg标准株：MgG-37，由东南大学流行病教研室提供；衣原体标准株E型，由天津市性传播疾病研究所提供；白念珠菌标准株(ATCC-11006)；加特那菌标准株(ATCC14018)。
　　
　　1.2标本采集
　　来天津医科大学总医院性病门诊就诊的患者224例，其中男性181人，女性43人。这些患者均有婚外性接触史，性伴数≥1，就诊一个月内未使用大环内酯类、四环素及喹诺酮类抗菌药物。采集方法：用铁杆棉拭子插入男性尿道或女性宫颈内2~3cm，留置2s，旋转4周后取出。把用于Mg检测的拭子置于含1ml灭菌生理盐水的?Eppendorf?管中，洗涤拭子，标本-20℃储存备用。
　　
　　1.3PCR方法
　　1.3.1标本处理取1m1分泌物标本，离心12000r／min×20min，弃上清液，向沉淀中加裂解液(50mM KCl，2.5mM MgCl2，10mM Tis-HCl（PH8.3），0.1g/L明胶，0.45%NP-40，0.45%吐温20，200mg/L蛋白酶K 90μl。混匀，55℃水浴90分钟，沸水浴15min灭活蛋白酶K后，再12000r/min离心3min，取含有DNA的上清液，做PCR扩增的DNA模板。
　　1.3.2引物本试验采用了由Jensen设计的两对引物。①Mg-Pa引物：MgPa1 5＇…AGTTGATGAAACCTTAACCCCTTGG…3＇；MgPa3 5＇…CCGTTGAGGGGTTTTCCATTTTTGC…3＇，预期扩增片断长度为281bp。②Mg的16S-rRNA引物：Mg16S-45F: 5＇…TACATGCAAGTCGAACGCAAGTAGC…3＇, Mg16S-44R: 5＇…AATCTCCAGCCATTGCCTGCTAG…3＇，预期扩增片断长度为402bp。
　　
　　1.3.3 PCR反应体系及条件25μl反应体系中依次加入10×PCRBuffer2.5μl，Mg2＋1.5μl，0.2mMeach的dNTPmix，0.48μM MgPa1(Mg16S-45F)，0.48μM MgPa3(Mg16S-44R)，临床标本提取物8μl（Mg标准株5μl），Taq DNA聚合酶0.625u。
　　反应条件：两对引物的反应条件相同。94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸 60s，共40个循环后；72℃后延伸5min，使反应完全。
　　反应结束后，以1.5％琼脂糖凝胶电泳30min，在透射式紫外灯下观察结果并摄像，出现与标准株PCR产物在同一水平的亮光带标记为阳性。每批标本设阳性及阴性对照，前者加Mg标准株，后者为阴性水对照。
　　
　　1.4敏感性及特异性试验
　　取标准株MgG-37 DNA以2倍稀释法进行各浓度的扩增。用各种相关微生物分别进行两对引物的特异性试验。
　　
　　2结果
　　
　　2.1阳性临床标本的扩增结果(图1)
　　其中泳道5为DNA Marker(由下至上为)100bp,200bp,300bp,400bp,500bp,600bp；泳道2，3以MgPa1/MgPa3为引物、泳道7，8以Mg16S-45F/Mg16S-44R为引物的临床标本的PCR扩增产物，分为281bp，402bp；泳道4,6分为两对引物反应体系的阳性对照；泳道1, 9为两对引物PCR扩增反应体系的阴性水对照。
　　
　　2.2敏感性试验结果(图2)
　　泳道5为Marker (由下至上为)100bp,200bp,300bp,400bp,500bp,600bp；泳道1，3，6，8是以MgPa1/MgPa3为引物的扩增产物的特异性条带，281bp；泳道2，4，7，9分别是相应浓度的MgG-37 DNA以Mg16S-45F/Mg16S-44R为引物的扩增产物的电泳结果，泳道2，4，7有特异性条带，402bp；泳道9无特异性条带产生。
　　
　　2.3特异性试验结果(图3,4)?
　　泳道4为Marker (由下至上为)100bp, 200bp, 300bp, 400bp, 500bp, 600bp；泳道1，2，3，5，6，7分别为衣原体E型，解脲脲原体，MgG-37，淋球菌，白念珠菌，加特那菌的PCR扩增产物的电泳结果。
　　图3,4示：除MgG-37在402bp和281bp有特异性条带产生外，其他菌株均在此位置无特异性条带产生。
　　
　　2.4STD门诊患者中男女不同人群Mg的检测
　　本试验为比较性病门诊中男女不同人群的Mg的感染率，分别对男女患者的检测结果进行了统计，结果见表1。
　　
　　3讨论
　　
　　由于Mg是一种对培养条件要求极高且生长缓慢的支原体，培养较难，至今国内外分离成功的报道很少，培养法在目前很难使用于临床。分子生物学方法是目前国内外用于检测Mg的主要方法，其中PCR应用最广泛。本实验采用PCR方法并选用了应用较广泛、特异性及敏感性均较好并由Jensen根据MgPa黏附基因和16SrRNA基因设计的两对引物：MgPa1/MgPa3和 Mg16S-45F/Mg16S-44R同时对临床标本进行检测并对其结果进行比较，这在国内外的文献中较少[2]，而Jensen[2]认为这种比较对保证结果的可靠性是非常重要的。
　　在本实验MgPa1/MgPa3和 Mg16S-45F/Mg16S-44R这两对引物对临床标本的检出率上无差别，但两对引物敏感试验结果示：最低一个浓度时，引物MgPa1/MgPa3扩增出的特异性条带，而以引物Mg16S-45F/Mg16S-44R为反应体系的扩增产物无特异性条带产生，这提示MgPa1/MgPa3的敏感性高于Mg16S-45F/Mg16S-44R。
　　
　　骆丹等[3]发现引物16SrRNA比MgPa引物扩增的阳性率略高。Jensen等[2]研究发现：MgPa1/MgPa3和 Mg16S-45F/Mg16S-44R扩增结果有很好的一致性，但MgPa基因存在异质性；16SrRNA基因有种属特异性，以高度保守区域16SrRNA基因为目的基因PCR实验是具有特异性和敏感性的另一最佳方法，同时能降低种内遗传多态性的易感性，是基于MgPa试验广泛应用的有价值的补充，能提高检测Mg的阳性率。

  
  
       　　本实验结果和骆丹、Jensen等发现引物16SrRNA比MgPa引物扩增的阳性率略高的结果略有差异，这可能与本实验所检测的临床标本数量较他们检测的临床标本数量较少有关，也许和Mg基因存在着地区异质性有关。
　　本实验结果示MgPa1/MgPa3和 Mg16S-45F/Mg16S-44R这两对引物均有很好的特异性，它们在特异性方面没有差异。这与国内外文献报道相一致。
　　国内外许多学者对不同人群进行了Mg的检测及研究[3，4]。国外报道用PCR检测STD门诊患者结果5%~27%Mg阳性[5]，王荷英等[6]报道STD门诊患者Mg感染率超过14%。孔繁荣等[7]报告北京地区STD门诊患者Mg感染率为4%。本实验结果示天津医科大学总医院STD门诊患者Mg感染率为3.57%，略低于国内外文献的报道，考虑与下列因素有关：(1)低阳性率与PCR方法有关：虽然PCR具有快速、敏感、简便等一系列的优点，但它受影响的因素较多，比如TaqDNA聚合酶抑制物的存在等，从而影响结果。(2)低阳性率与检测人数少可能有关，要想得到更精确的阳性率还需进行更大范围的调查和检测。(3)天津地区人群的Mg阳性率就是较其他地区低。王自正等[8]研究结果显示：Mg感染的地区分布可能与我国性病的地区分布有关，广东等沿海地区性病的发生率较高，结果Mg的阳性率也较其他地区明显高。南京、上海等地区次之，内地如华北地区性病发生率较低，故Mg阳性率可能较低。
　　本实验示：STD门诊男性患者的Mg阳性率为3.57%，与STD门诊女性患者的Mg阳性率为2.33%比较没有统计学差异。这与国内常哲[9]等研究结果相一致，但与Jensen等[2]报告的STD门诊男性患者的Mg阳性率高于女性患者的Mg阳性率不符。考虑原因如下：(1)本实验所测女性临床标本的数量少，这样可能造成样本率与总体率有差异。(2)男性和女性有着不同的对健康的重视程度和检查意识，受检者中男性无症状的比例高于女性。
　　本实验建立了适合本实验室的用于临床标本检测的PCR方法，为了解天津地区高危人群的Mg感染状况和为临床医师的诊断和治疗提供了参考依据。
　　
　　参考文献?
　　1 Tully JG, D. Taylor-Robinson, RM Cole, and DL Rose. A newly discovered mycoplasma in the human urogenital tract[J]sup. Lancet, 1981:1288.?
　　2 Jensen JS, Borre MB, Dohn B. Detection of mycoplasma genitalium by PCR amplification of 16SrRNA gene[J]sup. J Clin Microbiol. 2003, 41(1)261-266.?
　　3 骆丹,胡春梅,梁国钧，等．聚合酶链反应技术检测生殖支原体感染[J]sup. 临床皮肤科杂志，1998,27(4):216-218.?
　　4 Taylor-Robinson D, Gilroy CB, Hay PE. Occurrence of mycoplasma genitalium in different populations and its clinical significance[J]sup. Clin Infect Dis.1993,17(1):66.?
　　5 Mena L,Wang X, Mroczkowski TF, et al. Mycoplasma genitalium infections in asymptomatic men and men with urethritis attending a sexually transmitted diseases clinic in New Orleans[J]sup. Clin Infect Dis, 2002, 35: 1167-1173.?
　　6 王荷英,施美琴,叶顺章,等. 451例STD患者的生殖支原体感染[J]sup. 临床皮肤科杂志，2002,31(9):543-544.?
　　7 孔繁荣,朱学云,周骏马,等.泌尿生殖道人型支原体和生殖支原体的检测[J]. 临床皮肤科杂志，1996, 6(1): 17.?
　　8 王自正, 王书奎, 骆丹,等. 多重聚合酶链反应检测生殖支原体感染[J]. 中华医学检验杂志,1998, 21(1):36-39.?
　　9 常哲,吴移谋. 生殖支原体的分子生物学诊断方法研究进展[J]. 中华传染病杂志,1999,17(4):25-28.