2018儿童急性B淋巴细胞白血病(B―ALL)调节性T淋巴细胞变化及调节机制

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　　[摘要] 目的 分析?和?急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）调节性T淋巴细胞变化及调节机制。 方法 在2016年2月23日～2017年2月23日期间选取50例健康体检者（对照组）、50例急性B淋巴细胞白血病患儿（观察组）为实验对象，对两组受检者均进行分离外周血CD4+T细胞、荧光定量PCR（RT-PCR、REAL-TIME PCR、总RNA定量和提取、RT-PCR产物鉴定）、酶联免疫吸附试验、流式细胞术检测，随后对比两组受检者各项检测结果。 结果 观察组患儿的CD28/CD4+Foxp3+（524.86±28.42）、ICOS/CD4+CD25high Foxp3+（725.69±15.74）、TGF-βRII/CD4+（61.75±10.08）、Mtge-β（58.44±10.85）、IL-35p35（326.84±35.46）、IL-35EB13（128.56±12.74）、TGF-β（81.46±5.43）、IL-10（135.75±12.75）、ICOS+/CD4+CD25high Foxp3（3.86±1.75）%、 Foxp3（812.43±56.32）、CD4+CD25high Foxp3（9.85±2.45）%均高于对照组健康体检者的CD28/CD4+Foxp3+（158.33±21.06）、ICOS/CD4+CD25high Foxp3+（352.12±10.03）、TGF-βRII/CD4+（28.42±5.89）、Mtge-β（23.17±5.33）、IL-35p35（154.28±26.31）、IL-35EB13（48.31±6.52）、TGF-β（29.51±6.38）、IL-10（24.91±5.22）、ICOS+/CD4+CD25high Foxp3（2.45±0.85）%、 Foxp3（322.41±18.75）、CD4+CD25high Foxp3（4.12±1.75）%（P /6/view-10764414.htm
　　[关键词] 急性B淋巴细胞白血病；T淋巴细胞；调节机制；酶联免疫吸附试验
　　[中图分类号] R73 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）31-0005-04
　　[Abstract] Objective To analyze the changes and regulatory mechanism of regulatory T lymphocytes in children with acute B lymphocytic leukemia（B-ALL）. Methods A total of 50 children of healthy subjects （control group） and 50 children with acute B lymphocytic leukemia （observation group） who were selected from February 23rd， 2016 to February 23rd， 2017 were selected as the study subjects. CD4+ T cells were isolated from peripheral blood in both groups， and quantitative PCR（RT-PCR， REAL-TIME PCR， total RNA quantification and extraction， RT-PCR product identification）， enzyme-linked immunosorbent assay， and flow cytometry were carried out， and then the results of each test were compared between the two groups. Results CD28/CD4+Foxp3+（524.86±28.42）， ICOS/CD4+CD25high Foxp3+（725.69±15.74）， TGF-βRII/CD4+（61.75±10.08）， Mtge-β （58.44±10.85）， IL-35p35 （326.84±35.46）， IL-35EB13（128.56±12.74）， TGF-β（81.46±5.43）， IL-10（135.75±12.75）， ICOS+/CD4+CD25high Foxp3（3.86±1.75）%， Foxp3（812.43±56.32）， CD4+CD25high Foxp3（9.85±2.45）% in the observation group were all higher than CD28/CD4+Foxp3+（158.33±21.06）， ICOS/CD4+CD25high Foxp3+（352.12±10.03）， TGF-βRII/CD4+（28.42±5.89）， Mtge-β（23.17±5.33）， IL-35p35（154.28±26.31）， IL-35EB13（48.31±6.52）， TGF-β （29.51±6.38）， IL-10 （24.91±5.22）， ICOS+/CD4+CD25high Foxp3（2.45±0.85）%， Foxp3（322.41±18.75）， CD4+CD25high Foxp3（4.12±1.75）% in the healthy subjects in the control group（P  　　[Key words] Acute B lymphocytic leukemia（B-ALL）； T lymphocyte； Regulatory mechanism； Enzyme-linked immunosorbent assay
　　急性B淋巴细胞白血病属于临床常见疾病，发病机制尚未明确；随着相关报道的增多，部分学者认为其与免疫水平低下和白血病细胞恶性克隆有关，但具体的抗肿瘤免疫功能异常机制尚不明确[1-3]。调节性T细胞属于细胞亚群，是一种具有调节、免疫功能的细胞，能够参与细胞调节和抑制肿瘤[4]。随着对急性B淋巴细胞白血病的深入探索，可发现CD4+CD25high Foxp3细胞可通过分泌细胞因子和细胞间接触，促使肿瘤细胞活化、发育的抑制，控制肿瘤组织的生长、发育[16]。根据肿瘤功能方式和表面标记分值表达的差异，可将其分为ICOS-Foxp3+TREG和ICOS-Foxp3+两种完全不同的细胞亚群，其中前者主要依赖结合型接到细胞间接触抑制，后者能够发挥免疫抑制功能。而本文旨在探索急性B淋巴细胞白血病调节性T淋巴细胞变化的临床意义，现报道如下。
　　1 资料与方法
　　1.1 一般资料
　　本次研究对象为2016年2月23日～2017年2月23日期间收治的50例急性B淋巴细胞白血病患儿、50例健康体检者，其中对照组为健康体检者，观察组为急性B淋巴细胞白血病患儿。入选标准：（1）本次实验对象患儿家长均了解、知情、同意本次实验；（2）受检者均能够配合实验人员完成本次操作；（3）受检者均无严重心功能、肝肾功能等实质性脏器功能受损；（4）受检者均能够完成正常交流；（5）受检者均无本次实验制剂过敏；（6）受检者均无精神家族史[5]。观察组平均体质量（22.42±0.72）kg，平均年龄为（10.74±0.85）岁，男20例，女30例。对照组平均体质量（22.51±0.79）kg，平均年龄为（10.33±0.71）岁，男21例，女29例。两组受检者基本资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
　　1.2 方法
　　分离外周血CD4+ T细胞：抽取受检者静脉血3 mL后，进行离心法分离（使用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度法），检测外周血单个核细胞，且使用美国INVITROGEN公司提供的试剂盒，检测外周血CD4+T细胞（实施免疫磁珠分离法），流式细胞术检测细胞纯度>97%；锥虫蓝染色判定细胞活力>95%[6-7]。
　　荧光定量PCR：（1）RT-PCR：选用立陶宛MBI公司提供的试剂盒，进行逆转录合成CDNA，且需其中1 μL作为模板，实施扩大循环，再参照GENBANK中基因MRNA序列设计相关引物；（2）总RNA定量和提取：选用美国AMBION公司提供的AM1912试剂盒，检测外周细胞因子，且收集样本后，进行分离处理，再按照步骤进行紫外分光光度测定RNA含量；（3）REAL-TIME PCR：选用大连宝生物提供的SYBGREEN试剂盒，进行荧光量测定，具体方式如试剂说明书；（4）RT-PCR产物鉴定：取10 μL β-actin扩增产物、Itch、TGF-β诱导早期基因1、SMAD4、SMAD3在2%琼脂糖凝胶中，且进行回收纯化，进行30 min的90 V电泳，并交由上海技术有限公司测定。将其结果与基因mRNA序列比较，Itch、TGF-β诱导早期基因1、β-actin扩增产物、SMAD4、SMAD3与GENBANK中目的基因序列完全一致[8-11]。
　　酶联免疫吸附试验：抽取两组受检者空腹外周静脉血2 mL，且实施分离血清处理，离心操作维持10 min，每分钟800 r速度进行，将上层血浆分离后，可使用美国EBIOSCIENCE公司提供的BMS249/3型号的双抗体夹心法检测血浆中TGF-β浓度，具体方式如说明书。
　　流式细胞术检测：首先将CD4-EFLURO450设门使用全血直接计数法检测，且进行破膜、固定处理，经可诱导性T细胞共刺激分值、CD25-PECy7、TGF-β-PE、Foxp3-APC等抗体染色30 min，再检测CD4+ CD25high ICOS Foxp3+细胞比例和其表明膜结合型蛋白表达水平。同时另外抽取外周血1 mL，经体外刺激，实施蛋白转运抑制剂，且在5% CO2，37 ℃温度下，孵育6 h后，再次检测各项指标[12-13]。
　　1.3 观察指标
　　对比两组受检者的CD28/CD4+Foxp3+、ICOS/CD4+CD25high Foxp3+、TGF-βRII/CD4+、Mtge-β、IL-35p35、IL-35EB13、TGF-β、IL-10、ICOS+/CD4+CD25high Foxp3、 Foxp3、CD4+CD25high Foxp3。
　　1.4 统计学方法
　　使用SPSS17.0统计学软件处理数据，计数资料比较采用χ2检验，计量资料比较采用t检验，P  　　随着对急性B淋巴细胞白血病的深入探索，可发现CD4+CD25high Foxp3细胞可通过分泌细胞因子和细胞间接触，促使肿瘤细胞活化、发育的抑制，控制肿瘤组织的生长、发育[16]。根据肿瘤功能方式和表面标记分值表达的差异，可将其分为ICOS-Foxp3+TREG和ICOS-Foxp3+两种完全不同的细胞亚群，其中前者主要依赖结合型接到细胞间接触抑制，后者能够发挥免疫抑制功能。在早期报道中，可发现血液恶性肿瘤和实体瘤容易出现功能异常现象，主要表现为肿瘤发生、发展与TREG细胞存在密切关系，而本次实验中，可发现患有急性B淋巴细胞疾病的儿童，外周血CD4+CD25high Foxp3明显高于正常儿童，且水平值与机体免疫活性状态呈正比，由此证实，此项指标能够反映机体活化状态，而其升高的主要原因与肿瘤组织增大有关。随着研究的进一步探索[17-20]，可发现TREG细胞抑制功能状态和细胞转录因子表达存在一定关系，当儿童合并急性B淋巴细胞白血病时，可发现ICOS+Foxp3抑制性细胞因子IL-35、IL-10和细胞转?因子Foxp3表达均呈上调趋势，能够反映机体细胞亚群功能异常和过度活化，引起病情加重，而本次实验，也证实IL-10、ICOS+/CD4+CD25high Foxp3均高于正常儿童。
　　诱导TREG细胞的分子机制尚未明确，而TREG细胞能够促使转录因子Foxp3的表达，且在TREG功能维持、成熟、分化过程中发挥重要作用，被学者标志为TREG的特异性标志分子。当初始CD4+T细胞表面受体TGT-βRI/II和TGF-β结合时，可触发TIEGI和SMAD型号，前者能够在ITCH的协助下，增强Foxp3的表达因子，后者能够诱导Foxp3基因启动，同时初始去甲基化的表达，从而将CD4+T细胞分化为TREG细胞。而本次研究中，可发现急性B淋巴细胞白血病患儿TGT-βRI/II、CD4+T细胞、TGF-β浓度以及ITCH表达均呈现为上升趋势，其可能与患儿机体TGT-β信号过度活化或细胞数量异常有关，提示急性B淋巴细胞白血病患儿的TREG细胞功能和数量。
　　除了TGT-β信号外，ICOS+Foxp3细胞亚群分化也存在不同调节机制，ICOS可诱导ICOS+Foxp3细胞活化、增殖，与细胞表面配体ICOS结合，促进抑制性细胞因子的产生，强烈诱导ICOS+Foxp3细胞活化，而分析本次实验，可发现急性B淋巴细胞白血病患儿存在CD28和ICOS表达增高，其提示着细胞亚群异常活化，同时机体内多种亚群比例失调或细胞异常活化均与调节性细胞因子信号有关，其中CD28、ICOS、TGT-β信号过度活化具有重要作用，但其具体分子机制还有待进一步探索、研究。
　　总而言之，急性B淋巴细胞白血病患儿的亚群比例失调、细胞异常活化与多种调节性细胞因子信号有关，其中以TGF-β、CD28、ICOS过度活化最为常见，但由于本次实验样本有限，因此其分子机制还有待探索。
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　　（收稿日期：2017-08-04）