[摘要] 目的 研究中西药联合对多重耐药铜绿假单胞菌（MDR-PA）抗菌作用，为临床中西药联合治疗MDR-PA感染提供依据。 方法 赤芍、五倍子、野菊花、鱼腥草、小檗碱，煎煮法制备提取液，采用两倍稀释法观察中药对细菌的抑菌效果；采用棋盘格稀释法测定中西药的MIC，通过计算部分联合抑菌指数（FIC）的分布评价中西药联合效果。 结果 五种中药对MDR-PA有不同程度抑菌作用，五倍子对MDR-PA抑菌作用最强；亚胺培南与小檗碱、头孢他啶与五倍子联合有较好的协同相加作用，协同相加率超过80%。环丙沙星与五种中草药联合显示无关作用；三种抗生素与五种中草药联合均无拮抗作用。 结论 赤芍、五倍子、野菊花、鱼腥草、小檗碱对MDR-PA有不同程度抑制作用；亚胺培南与小檗碱、头孢他啶与五倍子联合可以增加各自对MDR-PA抗菌作用的敏感性。
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[关键词] 中西药联合；多重耐药铜绿假单胞菌；抗菌活性；协同作用
[中图分类号] R969.4 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2017）31-0107-04
[Abstract] Objective To study the antimicrobial effect of integrated Chinese and western medicine on multi-drug resistant pseudomonas aeruginosa（MDR-PA）， and provide the clinical basis for the integrated Chinese and western medicine treatment of MDR-PA infection. Methods Extract liquid from Radix Paeoniae Rubra， Chinese Gall， wild chrysanthemum， Houttuynia cordata， berberine was prepared by decocting method. The antibacterial effect of traditional Chinese medicine on bacteria was observed by double dilution method. The MIC of Chinese and western medicine was determined by checkerboard dilution method. The effect of integrated Chinese and western medicine was evaluated by calculating the distribution of partial fractional inhibitory concentration （FIC）. Results Five types of traditional Chinese medicine had different degrees of antibacterial effect on MDR-PA， in which the antibacterial effect of Chinese Gall on MDR-PA was the strongest； imipenem had a favorable synergistic effect with berberine， ceftazidime and Chinese Gall， and the synergistic rate combined was over 80%. Ciprofloxacin combined with the five Chinese herbs showed no effect； three types of antibiotics combined with five types of Chinese herbs had no antagonistic effect. Conclusion Radix Paeoniae Rubra， Chinese Gall， wild chrysanthemum， Houttuynia cordata， berberine have different degrees of inhibitory effect on MDR-PA. The combination of imipenem with berberine， ceftazidime and Chinese Gall can increase their susceptibility to antibacterial effect against MDR-PA.
[Key words] Integrated Chinese and western medicine； Multi-drug resistant pseudomonas aeruginosa（MDR-PA）； Antimicrobial activity； Synergistic effect
铜绿假单胞菌是临床常见的条件致病菌，也是院内感染重要致病菌之一，常引起呼吸道感染、尿路感染、伤口感染、败血症等。随着广谱抗菌药在临床的广泛使用，近年来多重耐药铜绿假单胞菌分离率不断上升，已成为临床感染治疗的难题。我国中医中药治疗疾病已有千年历史，不少中药具有抗菌、抑菌活性、逆转细菌耐药性。为了研究中西药联合对多重耐药铜绿假单胞菌（multidrug resistant pseudomonas aeruginosa MDR-PA，）抗菌作用，本文?x取五种抗菌作用较好的中草药分别与临床常用抗生素进行联合药敏试验，旨在为临床中西药联合治疗MDR-PA感染提供依据，现报道如下。
1 材料与方法 1.1 菌株来源
2015年5月～2016年12月临床分离鉴定的30株MDR-PA（剔除重复分离菌株），30株临床菌株通过法国梅里埃VITEK2-Compact鉴定与药敏检测。标本构成：痰液17株、尿液6株、伤口分泌物4株、血液3株（MDR菌株参照相关文献[1] 的判断标准）。质控菌株：ATCC27853，购自上海市临床检验中心。
1.2 中药水煎剂
赤芍、五倍子、野菊花、鱼腥草（购自养和堂药房），小檗碱（粉剂，中国药品生物检定所），M-H肉汤（购自上海伊华公司）、常用抗生素均由本院药剂科提供。
1.3 方法
1.3.1 中药原液的制备 分别称取上述中药50 g，按5倍量加入蒸馏水浸泡，4℃冰箱内放置24 h后，加热100 ℃ 30 min，过滤，将滤渣再加5倍水加热100 ℃ 30 min。将两次滤液混合加热浓缩至50 mL，生药含量为1 g/mL，调节pH为7.6，离心后留取上清，进行高压灭菌，4℃冰箱保存备用，参考穆廷杰[2]的中药原液制备方法。
1.3.2 菌悬液制备 MDR-PA菌株复苏后，从18～24 h 35℃培养的血琼脂培养基上挑选几个菌落于生理盐水中，调到0.5麦氏浓度（1.5×108 CFU/mL），稀释30倍，向两倍稀释好的药液的1～11支试管加100 μL菌悬液，最终接种量为5×105 CFU/mL。
1.3.3 药液的倍比稀释 中草药抗菌实验采用中草药抗菌实验试管法，参照相关文献[3]进行。药液采用2倍稀释法，即取72支无菌试管，每组12支编号，每管加1 mL肉汤；取上述中药原液，先在第一管加1 mL，混匀后加入第二管中，以此类推，至第10管吸出1 mL弃去，使1～10管含有倍比稀释的药液为1：2，1：4，1：8，1：16，1：32，1：64，1：128，1：256，1：512，1：1024。
1.3.4 加菌 MDR-PA菌株复苏后，从18～24 h 35℃培养的血琼脂培养基上挑选几个菌落于生理盐水中，调到0.5麦氏浓度（1.5×108 CFU/mL），稀释30倍，向两倍稀释好的药液的1～11支试管加100 μL菌悬液，最终接种量为5×105 CFU/mL，第11管为阳性对照管，第12管不加菌为阴性对照管。
1.3.5 中草药抗菌实验结果判读 35℃孵育18～24 h后观察，阳性对照管长菌需呈浑浊状，而肉汤空白对照管不长菌呈透明清亮状，在此前提下观察实验组的浑浊情况，MIC 是用肉眼在试管中所见能完全抑制细菌生长的最低抗菌药物浓度。
1.3.6 中西药联合药敏试验 联合药敏试验采用棋盘格微量稀释法检测药物的联合作用，采用9个稀释度，药物最高浓度为其MIC的4倍，依次倍比稀释为1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256倍浓度，两种药物分别在96孔培养板上按纵列和横列进行联合。接种菌量为5×105 CFU/mL，35℃孵育18～24 h后观察结果。
1.3.7 联合抑菌效应判断 根据部分抑菌浓度（fractional inhibitory concentration，FIC）分布判断联合用药效果。FIC的计算：FIC=MIC甲药联合/MIC甲药单用+ MIC乙药联合/MIC乙药单用，其中MIC为最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。结果判断：（1）FIC指数≤0.5判定甲乙两药为协同作用；（2）0.52判定甲乙两药为拮抗作用。
1.4 统计学方法
采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行统计分析，中西药联合与单独使用时MIC数据为呈正态分布的计量资料，采用（x±s）表示，比较采用配对t检验，P鱼腥草>野菊花>赤芍>小檗碱。
2.2 中西药联合用药时FIC指数分布
通过计算FIC值评价联合药敏试验效果，得出30株MDR-PA对不同中西药物组合时FIC指数分布。亚胺培南与小檗碱联合效果最佳，60%菌株呈现协同作用，40%菌株呈现相加作用，头孢他啶与五倍子联合有30%菌株呈现协同作用，50%菌株呈现协同作用，协同相加率超过80%。环丙沙星与五种中草药联合显示无关作用；三种抗生素与五种中草药联合均无拮抗作用。见表1。
2.3 不同中西药组合单独与联合使用情况下MIC值比较
头孢他啶与五倍子组、亚胺培南与小檗碱组单独与联合使用情况下MIC值的比较，中西药联合时用药量低于单独使用时用药量。采用配对t检验，两者存在显著性差异（P 从本研究结果上看，五种中药提取物对多重耐药铜绿假单胞菌具有一定抗菌作用，与相关文献[15]报道一致，五倍子抗菌效果最好，抑菌效价达到215～1024，抑菌作用由强至弱为：五倍子>鱼腥草>野菊花>赤芍>小檗碱。对30株MDR-PA的中西药联合药敏试验，亚胺培南与小檗碱联合效果最佳，协同相加率为100%，亚胺培南的药物浓度平均降低至原来2/3，小檗碱的药物浓度从275 mg/mL降至20.80 mg/mL（P参考文献]
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（收稿日期：2017-08-12）
发表于 2018-8-15 13:31:00