2018隐丹参酮对乳腺癌MDA―MB―231细胞迁移、侵袭的影响及其机制

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　　[摘要] 目的 探讨隐丹参酮对乳腺癌MDA-MB-231?胞迁移、侵袭的影响及其机制。 方法 用不同浓度的隐丹参酮处理 MDA-MB-231 细胞24 h。采用 MTT、划痕实验和Transwell侵袭实验测定不同浓度隐丹参酮对MDA-MB-231细胞活性、迁移和侵袭的影响。采用Western blot检测MDA-MB-231细胞中c-Src、p-c-Src Tyr416、FAK、p-FAK Tyr576/577、MMP2蛋白表达水平。 结果 与0 μmol/L对照组相比，5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L隐丹参酮组对 MDA-MB-231 细胞存活率显著降低，且呈剂量依赖（P /6/view-10764248.htm
　　[关键词] 隐丹参酮；乳腺癌；MDA-MB-231细胞；迁移；侵袭
　　[中图分类号] R273 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）35-0016-05
　　[Abstract] Objective To investigate the effects and molecular mechanism of Cryptotanshinone on migration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells. Methods MDA-MB-231 cells were treated with different concentrations of Cryptotanshinone for 24 h. The effects of Cryptotanshinone on cell viability， migration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells were assessed by MTT assay， wound healing assay and Transwell invasion assay. The protein levels of c-Src， p-c-Src Tyr416， FAK， p-FAK Tyr576/577， MMP2 were detected by Western blot. Results The results showed that 5 μmol/L， 10 μmol/L， 20 μmol/L， 40 μmol/L Cryptotanshinone groups significantly reduced the viability ability of MDA-MB-231 cells in a dose-dependent manner， compared with the control group（P  　　1 材料与方法
　　1.1 材料来源
　　乳腺癌 MDA-MB-231?胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库；隐丹参酮购自成都曼思特生物科技有限公司（纯度>98%）（图1）。将隐丹参酮溶于DMSO配制成等20 mmol/L的储备液，分装后于-20℃储存，避光保存；使用时用无血清 RPMI 1640 培养液稀释为5 μmol/L，10 μmol/L，20 μmol/L，40 μmol/L的工作液，DMSO终浓度为 0.1%，对照组为含0.1% DMSO的细胞培养液。胎牛血清和 RPMI 1640 培养基购自Hyclone 公司；兔抗人 c-Src、p-c-SrcTyr416、FAK、p-FAK Tyr576/577、MMP2和 β-actin 抗体和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG购自 Cell Signaling Technology公司；Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自美国Bio-Rad公司；Transwell 小室购自Corning公司；Matrigel基质胶购自美国 BD 公司；结晶紫染色液和RIPA裂解液购自碧云天生物技术有限公司。
　　1.2 方法
　　1.2.1 细胞培养 乳腺癌 MDA-MB-231 细胞在37℃，5% CO2条件下，常规培养于含 10%胎牛血清的 RPMI 1640 培养基。待细胞长满至80%左右单层时，用含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液进行消化、传代，取生长良好的细胞进行实验。
　　1.2.2 MTT法检测细胞活性 取MDA-MB-231细胞，接种于96孔板，每孔加入100 μL细胞悬液，细胞数1×104/孔，每组5个复孔。培养 24 h后，吸弃原培养液，各孔分别加入 200 μL 含有不同浓度隐丹参酮的工作液（0、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L），同时设调零孔。继续培养24 h后，利用 MTT 法在波长 490 nm 处检测各组样品吸光度值（A490）。细胞存活率=（实验组A值-对照组A值）/（对照组A值-空白组A值）×100%，对照组定义为 100%。实验重复3次。
　　1.2.3 细胞划痕迁移实验 取对数生长期MDA-MB-231细胞，接种于6孔板，1×106/孔，待细胞长满后，更换为不同浓度隐丹参酮的工作液（0、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L）继续培养24 h。然后用20 μL枪头于每孔中间做一划痕，用PBS将未贴壁的细胞洗去，加入2 mL无血清 RPMI 1640 培养液，划痕后24 h，于显微镜下拍照并计数迁移细胞数量，对照组定义为100%。实验重复3次。
　　1.2.4 Transwell侵袭实验 取对数生长期MDA-MB-231细胞，接种于6孔板，1×106/孔，待细胞融合至 80%时，更换为不同浓度隐丹参酮的工作液（0、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L）继续培养24 h。预先将基质胶用RPMI1640 培养基以 1：7～1：8 稀释后，每个小室内加入 50 μL，4℃风干过夜，然后小心吸出小室内残余液体，每孔加 50 μL无血清培养液，置于 37℃孵箱内，放置 30 min备用。取密度为 4×105/mL的各组细胞悬液100 μL加入上室内，每组均设复室。在下室中加入600 μL含10%FBS的RPMI 1640培养基，37℃，5%CO2培养箱中孵育24 h。取出Transwell小室，用棉签擦去上室内的细胞和基质胶，用PBS清洗两遍，4%的多聚甲醛固定液固定 30 min，1%结晶紫溶液中染色15 min，PBS 洗涤3次，风干，取下Insert膜，封片后在显微镜高倍镜下，随机选取10个视野，对侵袭至膜背面的细胞总数进行计数并拍照，取均值。对照组定义为 100%。实验重复3次。
　　1.2.5 Western blot检测蛋白水平 取对数生长期MDA-MB-231细胞，接种于6孔板，1×106/孔，待细胞融合至80%时，更换为不同浓度隐丹参酮的工作液（0、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L）继续培养24 h，收集细胞，4℃预冷的PBS洗涤3次，加入75 μL细胞裂解液，冰上裂解30 min，提取细胞总蛋白，bradford法测蛋白质浓度。取25 μg蛋白样品，10% SDS-PAGE电泳分离蛋白后转移至 PVDF 膜，用5%BSA/TBST封闭液室温下封闭1 h，洗膜后加入抗 c-Src、p-c-SrcTyr416、FAK、p-FAK Tyr576/577、MMP2和 β-actin-抗（1∶1 000稀释），4°C孵育过夜，TBST 洗膜3次，加入二抗（1∶1 000 稀释）室温下孵育2 h，TBST洗膜3 次，将化学发光增强液A和B等体积混匀涂抹于PVDF膜上，用Bio-Rad凝胶成像系统获取图像。实验重复3次。
　　1.3 统计学方法
　　采用 SPSS 17.0统计学软件对数据进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni 校正的t检验，P  　　[2] Jia LY，Shanmugam MK，Sethi G，et al.Potential role of targeted therapies in the treatment of triple-negative breast cancer[J]. Anticancer Drugs，2016，27（3）：147-155.
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　　（收稿日期：2017-09-11）