[摘要] 目的 制备马钱子碱微囊，考察其影响因素，找出最优方案。 方法 以壳聚糖和明胶为囊材，马钱子碱为囊心物，采用复凝聚法制备载药微囊。通过正交设计试验，以包封率、粒径为指标，确定最佳囊材比、囊心与囊材比及CaCl2的浓度，确定最优配方。观察其形态，测定其包封率、粒径、载药量、Zeta电位等。 结果 通过正交实验，制备马钱子碱微囊的最优配方：壳聚糖浓度为5 mg/mL，明胶浓度为4 mg/mL，CaCl2浓度为2%，囊心与囊材比为1∶3。3次平行制备所得的载药微囊的各参数的平均值：包封率为28.73%，粒径为2.15 μm，载药量为10.6%，Zeta电位为12.61 mV。微囊分散性好，表面平滑完整，囊壁清晰，无粘连。 结论 以壳聚糖和明胶为原料的复凝聚法制备马钱子碱微囊具有较高的包封率，且稳定性好，制备工艺简单。
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[关键词] 马钱子碱；微囊；壳聚糖；明胶
[中图分类号] R917.4 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2017）27-0042-04
Study on the preparation technology of brucine microcapsules
ZHANG Shaohai1 WANG Hong2 SHANG Xiaoguang2
1.Department of Pharmacology， Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053， China； 2.Hangzhou Medical College， Hangzhou 310053， China
[Abstract] Objective To prepare brucine microcapsules， investigate the influencing factors and find out the optimal scheme. Methods Chitosan and gelatin were used as the capsule materials，and brucine was taken as the core materials.Drug-loaded microcapsules were prepared by complex coagulation method. Through orthogonal design test， with the encapsulation efficiency and particle size as an indicator， the best ratio of capsule materials， ratio of core to materials and the concentration of CaCl2 were determined， and the optimal formula was determined. Its shape was observed， and the encapsulation efficiency， particle size， drug loading capacity and zeta potential were measured. Results Through orthogonal design test，the optimum formula for preparing brucine microcapsules was as follows： The concentration of chitosan was 5 mg/mL， gelatin concentration 4 mg/mL， CaCl2 concentration 2%， and the ratio of capsule core to capsule materials was 1∶3. The average values of the parameters of the drug-loaded microcapsules prepared in three parallel preparations： The encapsulation efficiency was 28.73%， particle size 2.15 μm， the drug loading capacity 10.6% and Zeta potential 12.61 mV. Microcapsules were with good dispersion， smooth and complete surface， clear wall， and no adhesion. Conclusion The preparation of brucine microcapsules with chitosan and gelatin as raw materials has a high encapsulation efficiency， and the stability is good and the preparation process is simple.
[Key words] Brucine； Microcapsules； Chitosan； Gelatin
?R钱子碱（brucine，C23H26N2O4?4H2O）为白色结晶性粉末，在水中微溶，味极苦，属剧毒品，是马钱科植物马钱子（Strychnosnuxvomical L1或云南马钱StrychnosPierriannas A.W.Hi11）种子的主要生物碱之一[1]。2010 版《中国药典》载其味苦，微温，有剧毒，归肝、脾经。有通络止痛、消肿散结之功。可用于跌打损伤，骨折肿痛，风湿顽痹，麻痹瘫痪，痈疽疮毒，喉咙肿痛[2]。近年来马钱子用于冶疗多种疑难杂症均取得奇特疗效，外用冶疗癌痛效果更佳。有文献报道，不同粒度的马钱子粉末中生物碱的体外释放速度很快，10 min的累计释放率达到50%～80%，在80 min时基本释放完全[3]。马钱子碱具有中枢毒性，因此这样的释放速度采用常规方法如口服、注射等给药往往风险较大，容易引起中毒，且药效较短。希望通过适当的制剂手段，延缓马钱子碱的释放速度，同时降低药物的毒性，达到安全用药的目的。 微囊化是利用高分子原料将固体或液体药物包封起来而形成直径1～250 μm的微型胶囊[4]。微囊具有保护物质免受环境条件的影响、掩蔽药物的刺激性、提高药效，减少副作用、增加药物稳定性、延长药物及靶向释放等功能[5，6]。经过微囊化后的药物又可以制备成各种剂型，如注射剂、散剂、植入剂、胶囊剂、颗粒剂等，方便临床用药[7，8]。本实验将马钱子碱包封在微囊中，使其给药部位能够稳定持续的释放所包裹的药物，维持恒定的血药浓度[9]，达到连续控制癌症疼痛的效果，以减少药物的副作用，提高疗效和患者生活质量。虽然已有有关马钱子碱微囊的研究报道[1，3，10]，但是采用复凝聚法[11，12]制备的报道很少，为了进一步研究马钱子碱制剂，本实验拟采用壳聚糖和明胶为囊材[11-15]，以马钱子碱为囊心物，复凝聚法制备马钱子碱微囊，以包封率、粒径为指标，确定最优制备配方。并对制备所得的微囊进行相应的质量评价和体外释放实验，以确保其质量符合要求。
1 材料与仪器
1.1 材料
马钱子碱（南京泽郎医药科技有限公司，含量≥98%）；明胶（上海试剂总厂，批号为20031006）；壳聚糖（上海伯奥生物科技有限公司，批号为080116）。其他化学试剂全部为分析纯或化学纯。
1.2 仪器
AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；SK8200HP超声波洗濯器（上海科导超声仪器有限公司）；IKARC-MAG HS4磁力搅拌器；FA25高速乳匀机（上海弗鲁克液体机器有限公司）；E200MV生物显微镜（南京尼康江南光学仪器有限公司）；TDL-40C低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；DKB-501A超级恒温水槽（上海森信实验仪器有限公司）；ZEN3690激光微粒测定仪（马尔文仪器）；激光粒度分析仪（上海精密科学仪器有限公司）；TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）。
2 方法和结果
2.1 马钱子碱的标准曲线的测定
2.1.1 马钱子碱测定波长的选择 精密称取27.5 mg马钱子碱，置于50 mL容量瓶，用蒸馏水稀释至刻度，再精密移取2 mL稀释25倍成0.022 mg/mL的溶液；以蒸馏水为空白，在190～400 nm波长范畴内进行光谱扫描，曲线见图1，从图中可看出，马钱子碱在270 nm有吸收，200 nm附近有末端吸收，因此选择270 nm作为马钱子碱的检测波长。并将所用的辅料进行以10倍的浓度在190～400 nm波长范畴内进行光谱扫描，结果显示辅料对药物的吸收没有影响。
2.1.2 线性范围及标准曲线的制作 精密称取12.5 mg马钱子碱原料药，置于100 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，作为储备液。取适量储备液用0.45 μm的微孔滤膜进行过滤，精密移取续滤液 1 mL，2 mL，3 mL，4 mL，5 mL和6 mL，置于25 mL的容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。采取紫外分光光度计在270 nm波长处测量吸光度，经线性拟合得标准曲线方程为A=0.0302C-0.0005（R2=0.999）。线性范围为0～30 μg/mL，结果见图2。
2.1.3 精密度测定 取上述浓度为5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL的标准溶液，分别加入最大处方量的辅料，1 d内连续测定5次，计算日内精密度，每日测定1次，连续测定5 d，计算日间精密度。结果显示日内精密度RSD为0.56%、0.35%、0.31%（n=5），日间精密度RSD为0.68%，0.74%，0.56%（n=5），所有的RSD均在1%以内，符合要求。
2.1.4 回收率实验 测定2.1.3项下的三个浓度溶液的吸光度值，并进行回收率和RSD值的计算，结果显示平均回收率分别为（99.75±0.52）%，（98.97±0.78）%，（99.56±0.45）%，RSD均小于1%（n=3），符合要求。
2.1.5 稳定性实验 取上述浓度为10 μg/mL的标准溶液，加入最大处方量的辅料，分别于1 h，2 h，3 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h在270 nm测定吸光度，结果显示溶液在12 h内稳定性良好。
2.2 微囊的制备及其优化[16-17]
2.2.1 微囊制备条件的选择及优化 称取适量明胶，用蒸馏水浸泡适宜时间，搅拌溶解完全后，加适量液体石蜡及司盘80，用高速乳匀机制成W/O型乳液；另称取对应比例的壳聚糖浸泡超声溶于2%醋酸溶液，加CaCl2及药物，制得含药壳聚糖溶液，调节磁力搅拌器温度为30℃，搅拌下将其滴加到W/O型乳液中，用NaOH调节pH 4.5，继续搅拌90 min，冰浴冷却至10℃，加适量戊二醛，搅拌120 min。加正丁醇适量，摇匀后静置30 min，溶液离心5000 rpm 15 min，沉淀用蒸馏水洗涤至无醛味，干燥，即得微囊。
通过查阅相关文献和预实验，选取对微囊形成及包封率影响较为明显的3个因素：壳聚糖与明胶的质量比（A）、CaCl2的浓度（B）以及囊心与囊材的质量比（C），每个因素有3个水平进行试验（表1），以包封率为主要评价指标，同时以微囊粒径为参考指标，选用L9（34）正交表进行试验，筛选出最优制备处方。正交试验结果见表2。
2.2.2 微囊包封率的测定[18] ?⒏鞔Ψ街票傅奈⒛一煨?液5000 rpm离心15 min后的上清液，用0.22 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液1～3 mL置于25 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，于270 nm波长处测量其吸光度值，以蒸馏水为空白。将测定的数值代入标准曲线，获得上清液的浓度，并根据下面公式计算包封率，结果见表3。
2.2.3 微囊载药量的测定[19] 精密称取25 mg干燥微囊，研钵中研磨粉碎，加入蒸馏水约15 mL，超声使微囊中的药物溶解完全后，转移至25 mL容量瓶中，定容，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液于270 nm测吸光度，用标准曲线计算浓度，按照下式计算载药量。见表2。 载药量（%）=微囊中的药物重量/微囊重量×100%
2.2.4 微囊粒径的测定 将制备所得到的微囊稀释到一定浓度后，用激光粒度分析仪和ZEN3690激光微粒测定仪（马尔文仪器）分别测定粒径与Zeta电位。处方筛选的微囊的粒径和Zeta电位结果见表2。
2.2.5 处方筛选及制备工艺优化结果[5-6，16-17，20-21] 正交试验结果级极差分析见表3，其中综合评分=包封率×0.6+D50×0.4。微囊??验的方差分析见表4。
从以上结果可以看出，3个因素的影响程度为B>A>C，即氯化钙的浓度>壳聚糖与明胶的质量比>囊心与囊材的质量比。最佳水平组合为A1B2C2，即制备马钱子碱微囊的最优配方：壳聚糖浓度为5 mg/mL，明胶浓度为4 mg/mL，CaCl2浓度为2%，囊心与囊材比为1∶3。
2.3 验证实验
按照所获得的最佳处方进行A1B2C2重复性试验，制得3个批次的马钱子碱微囊，测得其包封率分别为28.63%，28.74%，28.82%，均值为28.73%；载药量为10.35%，10.15%，11.31%，均值为10.6%；SMD为2.46 μm，2.75 μm，2.36 μm，平均SMD为2.52 μm；Zeta电位为12.37 mV，13.41 mV，12.04 mV，平均值为12.61 mV。
将所制得的马钱子碱微囊在10×10倍的生物显微镜下观察其形态，并拍下图像。再在40×10倍状态下观察并拍下图像，见封三图5和封三图6，微囊分散性好，表面平滑完整，囊壁清晰，无粘连。
3 讨论
马钱子碱作为马钱子生物碱中的主要成分之一，具有镇痛、抗炎作用，对整个中枢神经系统有选择性兴奋作用。马钱子碱占马钱子总生物碱质量的30%～40%，属于有毒成分，使用不当容易产生中毒甚至危及生命。如要使其发挥疗效，需要通过一定的制剂手段，控制体内药物量及释放速度，达到安全用药的目的。微囊作为一种制剂手段，采用合适的高分子材料和制备方法将药物包裹，通过选择的囊材的缓释作用，使药物在体内释放减慢，延长药效，避免了毒性反应的发生。
复凝聚法是常见的微囊制备方法，利用两种相反电荷的高分子原料作为复合囊材，在一定前提下交联，使囊材的溶解度降低而自溶液中析出，包裹囊心物成囊。本实验中采用的壳聚糖[12-13]和明胶两种囊材均为是天然化合物，无毒，有良好的生物相容性和可生物降解性，是比较常用的药用高分子材料，易得价廉。壳聚糖为聚阳离子型多糖，明胶为两性化合物，溶液中的pH大于等电点时使其带负电荷，因此实验中要注意调节pH，使明胶始终带负电荷。本实验通过正交实验法确定了微囊制备的最佳工艺并进行了验证。通过验证，采用最佳工艺制备的微囊粒径较小，流动性好，包封率和载药量较好，重复性好。
通过实验发现除了实验所考察的三个主要因素外，其他因素也会对微囊的制备产生一定的影响，如戊二醛、正丁醇、明胶的乳化程度等。实验过程中，戊二醛起到交联固化的作用，但是要严格控制加入的量，过多会使微囊粘连紧密，难以分离；加入量过少，固化不完全，不易形成微囊。必须要根据药物、囊材以及实验条件进行选择，以获取最合适的固化剂的用量，以确保获得流动性好的微囊。通过摸索，在本实验条件下戊二醛最适合的量为1 mL左右。
同时在实验中发现，在固化完全后，不加入正丁醇，微囊不能形成沉淀物，难以离心分离；加入正丁醇混匀后，可见底部有沉淀，由此可见正丁醇可以使微囊分离，起到促进固化的作用，进一步减少微囊间的相互粘连。
在明胶制备W/O型乳液时，应充分乳化，使明胶在液体石蜡中充分分散形成液滴，以便于在后面的成囊过程中能够充分与壳聚糖结合形成微囊，否则难以形成微囊，只是液滴。为了保证乳化完全，明胶必须充分溶解，液体石蜡时分数次加入，确保乳化完全。
本实验采用了药剂学中经常采用的正交实验法对处方筛选和制备方法的确定进行了优选，具有一定的精密度，但是对各因素之间的交互作用不能较好的考察，这需要进一步改进。实验制备得到的马钱子碱微囊的体外释放度及体内的溶出特性是否能达到预期的要求，还有待于进一步的研究。
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（收稿日期：2017-07-31）
发表于 2018-8-15 12:59:54