2018川芎抗脑缺血的神经胶质细胞Ube3a―as机制研究

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　　[摘要] 目的 ?^察川芎抗脑缺血的神经胶质细胞Ube3a-as机制。 方法 取清洁级昆明种小鼠66只，随机分为川芎组（n=22）、模型组（n=22）、对照组（n=22）。川芎组、模型组采用线栓法建立昆明种小鼠大脑中动脉阻塞（MCAO）局灶性缺血再灌注模型。川芎组利用立体定位仪在侧脑室注射川芎提取物治疗，模型组不接受任何治疗。采用Bederson评分法对小鼠神经学进行评估，并分离培养海马神经胶质细胞，通过GFAP免疫化学分析鉴定原代神经胶质细胞的纯度，分析川芎抗脑缺血的神经胶质细胞Ube3a-as机制。 结果 3组小鼠建模前Bederson评分比较差异无统计学意义（P>0.05）。川芎组与模型组建模后1天Bederson评分均显著高于对照组（P /6/view-10763029.htm
　　[关键词] 川芎提取物；脑缺血；神经胶质细胞；Ube3a-as机制
　　[中图分类号] R96 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）28-0031-05
　　[Abstract] Objective To observe the mechanism of chuanxiong against cerebral ischemic glial cells Ube3a-as. Methods 66 Kunming mice with the clean grade were selected and randomly divided into chuanxiong group （n=22）， model group （n=22） and control group（n=22）. The thread-occluded method was used to establish a model of middle cerebral artery occlusion（MCAO） focal cerebral ischemia and reperfusion of Kunming mice in chuanxiong group and the model group. Chuanxiong group was treated with injection of chuanxiong extract by stereotaxic device in the lateral ventricle. The model group did not receive any treatment. Mice neurology was assessed using the Bederson score method. The hippocampal glial cells were isolated and cultured. And the mechanism of chuanxiong against cerebral ischemic glial cells Ube3a-as was analyzed through identifying the purity of primary glial cells with GFAP immunochemical analysis. Results There was no significant difference in the Bederson score among the three groups before modeling（P>0.05）. The scores of Bederson in the chuanxiong group and model group at 1 day after modeling were significantly higher than those in the control group （P  　　[Key words] Chuanxiong extract； Cerebral ischemia； Glial cells； Ube3a-as mechanism
　　脑卒中（Stroke）是临床的常见病，为脑梗死及蛛网膜下腔出血的总称。临床上，根据脑卒中的类型可以将其分为缺血性脑卒中及出血性脑卒中，其机制均为中枢神经元及胶质细胞缺血缺氧性死亡[1]。目前，国际上对于脑卒中治疗以药物治疗为主，且有许多针对神经元保护的药物，但是药物长期疗效欠佳，难以达到预期的治疗效果[2]。神?血管单元（neurovascular unit，NVU）理论为神经元保护药物的开发提供了新的思路。神经元是神经系统的结构和功能的基本单位，主要由神经元、血脑屏障、小胶质细胞及细胞外基质构成。而血脑屏障包括[3]星形胶质细胞、血管内皮细胞、周细胞和基底膜。胶质细胞属于脑缺血后中枢神经系统第一受损细胞，易出现肥大、增殖等作用，从而形成相对复杂的“细胞因子网络”调控机制，因此，临床上针对神经血管单元进行药物开发提高脑卒中临床效果具有重要的作用[4]。
　　文献报道显示[5]：将川芎注射液运用于脑卒中效果理想，药物能提高临床疗效，促进机体恢复。川芎属于伞形科高木属植物，具有活血行气、消散淤血及祛风止痛等功效，药物中的活性物质为川芎嗪（TMP），能提高SOD活性，降低氧自由基对脊髓缺损的损失[6]。同时，TMP还能提高白介素-6含量，减轻机体内炎症反应，但是该结论尚未得到进一步证实[7]。为了探讨川芎抗脑缺血的神经胶质细胞Ube3a-as机制，本研究选取医院动物实验室昆明种小鼠66只，经建立相关模型后观察川芎对脑缺血的治疗效果及其作用机制，现报道如下。
　　1资料与方法
　　1.1主要仪器和试剂
　　采用的仪器和试剂主要有2，3，5-氯化三苯基四氮唑（批号2603c312）、戊巴比妥钠（批号 051135）、XTZ-D解剖显微镜、DMR+Q550 病理图像分析仪、MDT-380AT型超低温冰箱、超净工作台、0.6号尼龙渔线等，相关试剂和仪器厂家如下，见表1。
　　1.2 实验动物
　　选取医院动物实验室提供的昆明种清洁级小鼠66只（雄性42只，雌性24只），平均体质量（27.45±4.75）g，周龄（1～4）周，许可证号：SYXK2016-0160。饲养条件符合国家二级动物房饲养及运动干预，室温（23±3）℃，相对湿度：55.0%～60.0%，每天换风2次，并进行12 h黑夜、光照更替。对昆明种小鼠处理符合《关于善待实验动物的指导性意见》中相关规则，随机分为川芎组（n=22）、模型组（n=22）、对照组（n=22）。
　　1.3 实验方法
　　1.3.1 大脑中动脉阻塞（MCAO）局灶性缺血再灌注模型建立 川芎组、模型组采用线栓法建立昆明种小鼠局灶性缺血再灌注模型，对照组不做任何处理。利用锋利的剃须刀将尼龙渔线切割成段，每段4 cm，头端0.5 cm均匀包裹704硅橡胶，在常温下固定，时间24 h，镜头下筛选出头端光滑原段、直径为0.2～0.23 cm的尼龙线，备用。利用记号笔在线栓距离头端4 mm及8～9 mm部位进行标记，浸泡在生理盐水中，备用[8]。采用改良线栓法制备小鼠MCAO/R模型病进行适当的改进。将线栓从颈总动脉经颈外动脉，围术期仅分离结扎颈总动脉，不分离结扎颈外动脉及颈内动脉。小鼠腹腔内注射0.2 mL浓度为1%戊巴比妥钠麻醉，待麻醉生效后从颈部正中切口分离左侧颈总动脉4 mm到颈内动脉及颈外动脉分叉部位，穿双线，备用。结扎颈总动脉近心端，采用微动脉夹在颈总动脉分叉下方夹闭颈总动脉血流后，采用显微剪做一个小切口，插入线栓并固定在颈总动脉上[9]。松开微动脉夹，将线栓缓慢地沿着总动脉插入颈内动脉，操作过程中密切观察进入颈外动脉。线栓插入深度距颈总动脉分叉约4 mm时，提示线栓接近颈内动脉颅点。在插入距离颈总动脉8～9 mm时，提示线栓头端已经达到大脑中部起始部位。扎进丝线固定线栓，缝合切口，术后注意保温，待小鼠苏醒后单独放置在笼中。缺血3 h后拔出栓线并结扎颈总动脉残端，继续进行24 h灌注，完成动物模型的建立[10]。
　　1.3.2 昆明种小鼠的处理 昆明种小鼠模型建立完毕后第1天，川芎组利用立体定位仪在侧脑室注射川芎提取物治疗，有效成为分川芎，根据小鼠体重8 mg/100 g进行注射治疗，每天注射1次，连续注射3 d（1个疗程），对照组为健康小鼠，不做处理[11]。3 d后采用断颈方法处死小鼠，取小鼠海马，剪碎消化40 min后离心（2500 rpm×10 min），按106个/cm2密度进行接种，5%CO2孵育箱中培养7～9 d，待细胞融合80.0%后开始传代培养。
　　GFAP免疫化学分析鉴定原代神经胶质细胞的纯度。组织切片用0.01M PBS（pH7.4）冲洗3次后，用3% H2O2/甲醇溶液室温孵育切片30 min，消除组织中的内源性过氧化物酶活性。之后PBS充分冲洗切片3次，每次10 min。用含0.3% Triton X-100和5%正常山羊血清的0.01M PBS溶液室温孵育切片30 min。封闭处理完毕后弃去封闭液，分别用Rabbit anti-c-Fos抗体（1∶600稀释）、Rabbit anti-GFAP抗体（1∶500稀释）4℃孵育24 h。阴性对照用0.01M PBS代替一抗。孵育完毕后PBST（含1% Triton X-100冲洗切片3次，每次10 min。生物素标记山羊抗兔IgG二抗稀释液（用10%Triton X-100、10%山羊血清的0.01M PBS稀释，比例为1∶4），室温孵育切片2 h，随后用PBST充分冲洗切片3次，每次10 min。在 DAB 显色液（三蒸超纯水1 mL，依次加入浓缩型DAB试剂盒中的A、B、C试剂各50 μL，混匀）中，处理 5 min左右，PBS充分冲洗切片。切片经自然晾干后进行酒精逐级脱水（75%酒精，95%酒精，100%酒精（两级）和二甲苯（两级）透明，Olympus显微镜观察GFAP表达情况。   　　1.4 观察指标
　　观察建模前、建模后1 d、2 d及处死前昆明小鼠Bederson评分情况，得分越低，治疗效果越理想。Bederson评分标准[12]：0级：无神经缺损体征；1级：将小鼠尾巴提起，瘫痪侧前肢回收屈曲于腹下，正常侧前肢向地面伸展；2级：除1级体征外，向瘫痪侧推小鼠时阻力较从对侧明显降低；3级：除以上体征外，小鼠向瘫痪侧旋转。通过GFAP免疫化学分析鉴定原代神经胶质细胞的纯度[13]。取2～3代制备的细胞，接种在培养细胞中，运用siRNA转染原代神经胶质细胞，PCR检测细胞内Ube3a-as的RNA表达水平，相关操作步骤必须严格遵循仪器、试剂盒操作说明进行[14]。小鼠大脑组织经制备成4 μm切片，采用TTC染色计算脑梗死面积。
　　1.5统计学分析
　　采用SPSS18.0软件处理，计数资料采用[n（%）]表示，行χ2检验。计量资料以（x±s）表示，多组计量资料比较采用ANOVA方差分析检验方差齐性后行t检验、LSD检验，P0.05）。川芎组与模型组建模后的Bederson评分均显著高于对照组（P0.05）。川芎组与模型组建模后1 d、2 d直至处死前Bederson评分均显著高于对照组（P参考文献]
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　　（收稿日期：2017-08-01）