2018Hsp22保护SCA3/MJD转基因果蝇神经的机制

2290238

　　摘要：目的：探索Hsp22保护SCA3/MJD转基因果蝇神经的机制。方法：利用GAL4-UAS系统，使Hsp22在SCA3/MJD转基因果蝇模型的神经系统中表达。观察果蝇的羽化率，Western blot检查线粒体复合物I亚基NDUFS3的蛋白水平。结果：Hsp22诱导不能羽化的elav-GAL4/UAS系统启动的SCA3/MJD转基因果蝇部分羽化，线粒体复合物I亚基NDUFS3蛋白表达升高。结论：Hsp22可能通过改善线粒体功能对SCA3/MJD转基因果蝇神经起保护作用。
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　　关键词：SCA3/MJD；线粒体功能；Hsp22；转基因果蝇模型；神经保护
　　中图分类号：R741
　　文献标志码：A
　　文章编号：1008-2409（2015）01-0021-03
　　脊髓小脑性共济失调是以小脑共济失调为主，表现为走路摇晃、突然跌倒和讲话含糊不清，以及双手笨拙、意向性震颤及眼球震颤、远端肌萎缩和痴呆等的神经退行性疾病。目前，发现SCAs基因亚型已经超过30种。其中，脊髓小脑性共济失调3型/马查多-约瑟夫病是最常见的SCAs亚型。在我国，SCA3/MJD几乎占SCAs患者总数的一半。
　　热休克蛋白（heatshock proteins，HSPs）广泛存在于从细菌至哺乳动物间的多种生物。机体遇到高温等刺激时，大量合成HSPs，以协助维持受累细胞的生理活动，减轻对机体的损害。小热休克蛋白22是HSPs的重要成员，定位于线粒体，具有分子伴侣活性、抗氧化应激及延长寿命等广泛生物学作用。笔者前期研究发现，Hsp22对SCA3/MJD转基因果蝇具有保护作用，而Hsp22对SCA3/MJD保护作用的机制尚不明确。为探讨Hsp22对SCA3/MJD保护作用的机制，笔者构建了elav-GAIA/UAS系统SCA3/MJD转基因果蝇模型，观察Hsp22表达对elav-GAL4/UAS系统SCA3/MJD转基因果蝇模型的影响。
　　1材料与方法
　　1.1材料
　　野生型基因W1118、双平衡基因Sco/cyo；TM3/TM6的果蝇由中南大学医学遗传学国家重点实验室捐赠；基因型w[*]；P{w[+mC]=UAS-Hsp/MJDtr-Q78}c211.2的8150果蝇品系（简称UAS-MJDtr-Q78果蝇），基因型P{w[+mW.hs]=GawB}elav[C155]的458果蝇品系（简称elav-GAL4果蝇）均购自美国Bloomington果蝇中心；Hsp22果蝇由Jose?Botella-Munoz赠予。
　　1.2方法
　　1.2.1elav-GAL4/UAS系统转基因果蝇羽化率测定 （1）elav-GAL4/UAS系统正常果蝇羽化率测定。将elav-GAIA处女蝇与W1118雄果蝇杂交，在25℃恒温培养箱中培养。在杂交第4天，清除亲代果蝇，并用毛笔轻扫起100只二龄幼虫（基因型为：elav-GAL4/W1118）于新的培养管中继续培养。杂交第10天开始统计羽化为成虫的果蝇数，并计算羽化率。（2）elav-GAL4/UAS系统SCA3/MJD转基因果蝇羽化率测定。将elav-GAL4处女蝇与UAS-MJDtr-Q78雄果蝇杂交，在与上组果蝇相同的时间，以同样的方法计算羽化率。（3）Hsp22干预elav-GAL4/UAS系统SCA3/MJD转基因果蝇的羽化率测定。将w；Sco/Cyo；TM3/TM6处女蝇与UAS-MJDtr-Q78雄果蝇杂交，构建w；AS-MJDtr-Q78/Sco；TM3/+果蝇；将w；Sco/Cyo；TM3/TM6处女蝇与UAS-Hsp22雄果蝇杂交，构建CyO/+；UAS-Hsp22/TM6果蝇。将上述两个子代雌雄果蝇杂交，选出w；UAS-MJDtr-Q78/CyO；UAS-Hsp22/TM3果蝇。将elav-GAL4处女蝇与UAS-MJDtr-Q78/CyO；UAS-Hsp22/TM3雄果蝇杂交，在子代中除去Cyo（卷翅）及TM3（短刚毛），并按上述方法分析100只幼虫，计算羽化率。
　　1.2.2Western blot测定果蝇NDUFS3蛋白表达
　　（1）组织蛋白提取。选取正常果蝇、SCA3/MJD疾病果蝇及Hsp22干预组果蝇二龄幼虫10只。加入300μl裂解液，分离总蛋白，并测定蛋白浓度。（2）配制合适上样浓度、变性，然后上样电泳。先用50mA、35min恒流，跑到分离胶时，调至70～80mA，1h。（3）蛋白分离后进行转膜。先高电压：200V，40W；再高电流：300mA，200W（45min时更换冰袋）进行半干转。（4）膜上蛋白抗原与抗-NDUFS3和二抗杂交。（5）底物进行ECL化学发光、显影与定影。
　　2结果
　　2.1果蝇羽化率
　　正常对照组果蝇幼虫均羽化成成虫，SCA3/MJD疾病果蝇在3龄幼虫期或化蛹期完全致死，其羽化率为0，而Hsp22干预组果蝇幼虫羽化率为28%，3组比较差异有统计学意义。Hsp22干预组果蝇幼虫羽化率高于SCA3/MJD疾病果蝇。
　　2.2果蝇NDUFS3蛋白表达
　　SCA3/MJD疾病果蝇的NDUFS3蛋白条带颜色浅，灰度低，其NDUFS3蛋白表达低于正常对照组果蝇和Hsp22干预组果蝇。见图1。
　　3讨论
　　许多神经退行性疾病，如SCA3/MJD，帕金森病等，与线粒体功能障碍有关。果蝇与人类基因有高同源性，且体积小，繁殖快，饲养容易，基因组少。因此，果蝇成为遗传学理想的研究“载体”。果蝇的繁殖周期分为：卵、1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、蛹，最后羽化为成虫。elav-GAL4系统SCA3/MJD转基因果蝇多发育至3龄幼虫时即停止发育并死亡。线粒体是细胞生成ATP的场所，氧化呼吸链存在于线粒体内膜。线粒体功能障碍导致氧化呼吸链受损，ATP产出减少。线粒体氧化呼吸链复合物I（简称复合物I）是呼吸链电子传递的起始复合物，是电子传递过程的限速酶，其损伤会导致帕金森病的发生。复合物I由45个亚基组成，包括核基因编码行使电子传递作用的NDUFS3。前期研究发现，线粒体功能受损与SCA3/MJD、帕金森病等神经退行性疾病关系密切。
　　Hsp22是HSPs的重要成员，作为分子伴侣发挥抗氧化应激等功能。同时，Hsp22是一种线粒体蛋白，线粒体对活性氧簇非常敏感，提高Hsp22表达水平有助于保护线粒体蛋白防御氧化应激。Hsp22能够挽救elav-GAL4/+；MJDtr-Q78/+果蝇的羽化，而其作用机制尚不清楚。结合Hsp22、SCA3/MJD及线粒体之间的关系，笔者推测Hsp22可能通过恢复线粒体的功能，保护SCA3/MJD转基因果蝇的神经系统。为证实这个假说，笔者选取elav-GAL4，使MJDtr-Q78蛋白在果蝇CNS特异性表达。发现Hsp22重新表达，果蝇的羽化功能恢复，羽化率明显提高。Hsp22干预后，SCA3/MJD转基因果蝇幼虫体NDUFS3蛋白表达明显升高。揭示Hsp22可能通过保护线粒体功能来保护SCA3/MJD。
　　Hsp22对SCA3/MJD转基因果蝇模型线粒体功能有保护作用，热休克蛋白对线粒体功能障碍引起的疾病有潜在的治疗作用。
　　[责任编辑：向秋]