2018HPLC结合聚类分析法对不同产地侧柏叶中化学成分的比较分析

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　　摘要：目的建立一种分析侧柏叶中3种成分的HPLC方法，对不同产地的侧柏叶的含量进行测定，并结合系统聚类分析法对不同产地侧柏叶的化学成分进行分析。方法样品以甲醇超声提取，采用Agilent ZORBAX ODS柱（5μm，46×250 mm），以02%磷酸水溶液（V/V）：甲醇（65：35）为流动相，流速1 mL?min-1，检测波长254 nm，柱温30℃；应用高效液相色谱法同时测定侧柏叶中杨梅苷、芦丁及槲皮苷的含量，并运用聚类分析法对9个产地的侧柏叶进行分析。结果三个化合物的线性范围为0020～412μg，线性相关系数均大于0999；平均回收率为9709%～10323%。测得杨梅苷、芦丁及槲皮苷的样品含量分别为0～158 mg?g-1、012～023 mg?g-1及109～458 mg?g-1。结论不同产地的侧柏叶中3种成分的含量具有一定的差异，其中以山东济宁及河南濮阳的含量较高。
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　　关键词：侧柏叶；杨梅苷；芦丁；槲皮苷；高效液相色谱法；聚类分析
　　中图分类号：R2841文献标志码：A文章编号：1007-2349（2017）08-0078-02
　　侧柏叶为柏科植物侧柏PLatycladus orientalis（L）Franco的干燥枝梢和叶。具有凉血止血、化痰止咳、生发乌发等功效[1]，其中化痰止咳和止血的主要有效成分为黄酮类化合物[2]。近期研究表明[3，4]，侧柏叶中总黄酮类成分可以激活毛母细胞和促进血液循环，使毛发生长能力衰退的毛囊复活和促进血液循环后补充营养成分而发挥出养发、生发的作用。本研究采用高效液相法对不同产地侧柏叶中的三种黄酮类成分进行含量测定，并通过聚类分析等对不同产地的侧柏叶的含量进行分析比较，以期为侧柏叶的后期研究提供参考。
　　1仪器与材料
　　11仪器高效液相色谱仪（Waters e2695-2998）、分析天平（AG285，Mettler Toledo）、超纯水发生器（Milli-Q，美国密理博公司）、超声仪（TDL-40B，上海安亭科学仪器厂）。
　　12试剂试药样品：9批侧柏叶均自采及委托采集自9个不同产地，均由戚育芳正高级工程师鉴定为侧柏叶[PLatycladus orientalis（L）Franco]，样品存于云南省药物研究所分析检测研究室。
　　标准品：杨梅苷对照品（批号：111860-201102，纯度：938%）、芦丁对照品（批号：100080-201409，纯度919%）、槲皮苷对照品（批号：111538-201105，纯度：927%）均购于中国食品药品检定研究院。
　　试剂：甲醇（色谱级，Merk）；磷酸为分析级。
　　2实验方法
　　21供试品制备取侧柏叶适量，粉碎，过四号筛，混匀，取本品粉末05 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，称定重量，超声（功率500W，频率40kHz）处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，以045μm滤膜过滤，取续滤液，即得。
　　22对照品溶液制备分别精密称取杨梅苷、芦丁和槲皮苷对照品适量，于25mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，分别制成浓度为04120，02123和03797 mg?mL-1的混合标准溶液。
　　23色谱条件色谱柱：Agilent ZORBAX ODS柱（5μm，46×250 mm）；02%磷酸水溶液（V/V）：甲醇（65：35）；流速1 mL?min-1，检测波长254 nm，柱温30℃，进样量10 μL。
　　3结果
　　31含量测定方法学验证
　　311标准曲线分别精密吸取混合对照品溶液，用甲醇逐级稀释，进样10 μL，测定。以峰面积A为纵坐标，浓度C mg?mL-1为横坐标，绘制标准曲线，见表1。
　　312精密度试验取混合标准品溶液，连续进样6次，RSD%均小于10%，说明仪器的精密度良好。
　　313稳定性试验精密吸取同一供试品溶液（安徽亳州），分别于0、2、4、8、12、24 h测定。RSD%均小于18%，说明24 h内样品的稳定性良好。
　　314重复性试验精密称取侧柏叶（安徽亳州）粉末共6份，按“21”项下方法制备溶液，分别?M样，记录峰面积，计算3种成分含量，RSD%均小于23%，说明方法重复性好。
　　315加样回收率试验精密称取已知含量的侧柏叶（安徽亳州）025 g，加入对照品适量，制备6份，分别测定。3种对照品的加样回收率均在9709%到10323 %之间，RSD%均小于27%，说明加样回收率良好。
　　32样品含量测定分别取不同产地的侧柏叶，每批取3份，按“21”项下方法制备供试品溶液，并按“23”项下色谱条件进行分析。从表2和图1中可以看出，不同产地3种成分的含量有所差别，其中芦丁含量均较低，槲皮苷含量较高。
　　33化学计量分析系统聚类分析是一种将研究对象分为相对同质的群组的统计分析技术，本试验根据所测样品的3个化学成分的定量分析数据，运用SPSS Statistics 24软件的Q型聚类法对9批不同产地的侧柏叶样品进行聚类分析，结果见图2。由图2可知，侧柏叶中的3种黄酮类成分含量与其产地生长环境存在着一定的联系，产地接近时含量差异较小。其中内蒙赤峰3种成分含量较低为一类，山东济宁与河南濮阳的3种成分含量较高聚为一类。
　　4讨论
　　本研究建立了HPLC法测定侧柏叶中杨梅苷、芦丁及槲皮苷3种黄酮类成分的含量测定方法，并对9个不同产地的侧柏叶进行了含量测定。结果表明不同产地的侧柏叶中3种成分的含量具有一定的差异，其中以山东济宁及河南濮阳的含量较高，而内蒙赤峰的含量较低。通过本次研究以期为不同产地侧柏叶中有效成分的后期研究提供参考。
　　参考文献：
　　[1]中国药典2015年版一部[S].2015：215
　　[2]张俊飞，孙广璐，张彬，等侧柏叶药理作用的研究进展[J].时珍国医国药，2013，9（24）：2231-2233
　　[3]陈兴芬，单承莺，马世宏，等侧柏叶化学成分、生理活性及防脱功能研究进展[J].中国野生植物资源，2010，3（29）：1-5
　　[4]潘宪伟，赵余庆侧柏叶和果实中黄酮类和萜类物质的现代药学研究进展[J].中草药，2012，8（43）：1641-1646