2018论视神经离断对神经干细胞定向诱导分化的影响

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　　　[论文关键词]干细胞；组织培养；视网膜神经节细胞；细胞分化；
　　[论文摘要]　目的　探讨大鼠视神经离断对神经干细胞一上丘组织共培养诱导分化的影响。方法采用机械分离，无血清选择培养的方法从孕14d的胚鼠上丘中获取神经干细胞并进行传代培养。使用免疫荧光技术对神经干细胞进行鉴定。采用显微手术的方法建立大鼠视神经离断模型，分别取正常大鼠、假手术和视神经离断大鼠的上丘组织进行体外培养。使用组织一细胞共培养系统将大鼠上丘组织与神经干细胞共培养，观察干细胞分化过程，对分化细胞进行鉴定，并与干细胞的自然分化过程进行比较。结果从胚鼠上丘中获得的细胞在无血清培养条件下聚集呈球形悬浮生长，可形成单细胞克隆，具有多向分化能力，经免疫荧光鉴定证实为神经干细胞。视神经离断大鼠的上丘组织与胚胎上丘源神经干细胞共培养可以促进神经干细胞的分化，并诱导分化出Thyl.1阳性的视网膜神经节细胞。结论从胚胎大鼠上丘可以分离培养出神经干细胞，与视神经离断大鼠的上丘组织共培养可以诱导上丘源神经干细胞分化为视网膜神经节细胞。
　　1材料与方法
　　1.1主要材料和试剂
　　孕14d和3个月龄SD大鼠均由复旦大学医学院实验动物中心提供。高糖DMEM／F12、Neurobasa1、N2、B27购自美国Gibeo公司；EGF、b-FGF购自美国RD公司；小鼠抗Nestin单克隆抗体、小鼠抗Thyl.1单克隆抗体购自美国Chemieon公司；兔抗GFAP购自武汉博士德公司；兔抗MAP-2单克隆抗体购自美国SantaCruz公司。
　　1.2动物分组与视神经离断模型
　　取3个月龄sD大鼠30只，雌雄不拘，随机分为3组：正常对照组、假手术组和视神经离断组，每组动物均为10只。视神经离断组大鼠随机选择一侧眼，在手术显微镜下钝性分离显露视神经；在离后极约2mm处剪断视神经。术后于直接检眼镜下观察视网膜血供良好者纳入试验。假手术组动物外科操作同视神经离断组，但不离断视神经。正常对照组则不做任何处理。
　　1.3胚胎上丘NSCS的分离与培养
　　取孕14d的SD大鼠，孕鼠孕龄的计算方法为：将雌雄大鼠合笼后，次晨检查发现阴栓者为孕0天。按照大鼠脑解剖图谱细心分离出上丘组织。胚胎上丘NSCS的分离与原代培养程序参见冯东福等已建立的方法。
　　1.4单细胞克隆及鉴定
　　将第2代的神经干细胞球，吹打成单细胞悬液。使用连续稀释法，最终细胞密度为100／ml。参照Reynolds和Weiss的方法，建立单细胞克隆。
　　使用细胞免疫荧光法对传4代的细胞克隆进行鉴定，一抗为小鼠抗Nestin单克隆抗体(1:100)，二抗为羊抗小鼠IgGCy3(1:10)。使用TCS-SP2型激光共聚焦显微镜对荧光标记后的细胞克隆球进行观察，并进行计算机三维图像重建，激发波长为543mm。具体方法见冯东福等的报道。
　　1.5上丘组织培养
　　假手术组和视神经离断组大鼠在术后5d断头处死，取手术对侧的上丘组织，正常对照组随机取单侧上丘组织。上丘组织培养采用我们已经建立的方法。
　　1.6双室组织一细胞共培养系统
　　该系统由上下两室组成。上室为透明PET微孔(孔径0.4μm)滤膜培养小室(BectonDickinson产品)，下室为配套的24孔培养板，可将上室悬吊起来。共培养时将上下室组合起来。
　　1.7神经干细胞的自然分化
　　取传4代的NSCS悬液，从500r／min离心5min，弃上清，加入干细胞分化培养液(Neurobasal培养液+B27(1：50)+10％FBS+谷氨酰胺4mmol／L)轻柔吹打。调整细胞密度为1×105／ml后将1ml悬液滴入下室，上室中不放组织块，仅加入分化培养液。把接种后的双室组织一细胞共培养系统放人C02培养箱中于37℃、5％CO2条件下贴壁培养。隔日用相差显微镜观察细胞生长分化情况，贴壁培养14d后进行荧光免疫细胞化学染色。1.8上丘组织一神经干细胞共培养诱导分化
　　将传4代的NSCS悬液以500r／min离心5min，弃上清，加入分化培养液轻柔吹打，调整细胞密度为1×105／ml后取1ml悬液滴入下室中于37℃5％C02条件下贴壁培养。3d后将已在体外培养4d的上丘组织移入共培养系统进行共培养。6d后将上室移去，神经干细胞继续培养至14d。
　　1.8分化细胞的鉴定
　　细胞免疫荧光染色步骤同前，根据需要上不同的一抗，抗体工作浓度分别为：MAP-2(1:50)、GFAP(1:100)、Thyl.1(1:100)。根据不同的一抗选择FITC或Cy3荧光二抗。阴性对照使用PBS液代替一抗。对Thyl.1阳性的培养孔，每孔随机选择3个克隆，在细胞疏松区域选择4个不同视野，记数总细胞数和Thyl.1阳性细胞数，计算阳性率。
　　
　　2　结果
　　2.1上丘神经干细胞克隆形成及鉴定
　　大鼠胚胎上丘细胞接种48h后培养液明显黄变，大部分细胞死亡，存活的部分细胞胞体增大，折光性增强，伴有明显光晕。部分细胞出现分裂相，细胞可成对出现。随着培养时间的延长，细胞团逐渐增大，呈球形悬浮生长，边缘细胞折光性较强。对第2代细胞进行单细胞克隆培养后发现，细胞可形成亚克隆，这些来自单个细胞的亚克隆可以进行传代培养，并大量增殖。
　　使用激光共聚焦显微镜，进行三维重建后可以清晰地看到克隆球呈Nestin阳性，中心的细胞较为
　　2.2分化细胞的鉴定
　　NSCS的自然分化和各共培养组合诱导分化分化情况。各组神经干细胞大部分均分化为GFAP阳性的神经胶质细胞。少量分化为MAP-2阳性的神经元。但只有上丘源NSCS与视神经离断组的上丘组织共培养后可见有Thyl.1阳性的视网膜神经节细胞分化。在该组分化的细胞中，Thyl.1阳性细胞的比率为14.92％