[摘要]三七总皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS）作为三七（Panax notoginseng）的主要活性成分，具有多种药理作用和临床应用，广泛应用于药品、保健品、日化品等行业。随着PNS的需求量日益上升，PNS的提取、分离纯化技术显得尤为重要。目前，PNS的提取、分离纯化技术的研究甚多，综合考虑其提取率、经济效益及规模化生产等因素，常采用乙醇回流提取，经大孔吸附树脂分离纯化，部分联合酶解技术和醇沉技术制备PNS。本文将对近年来实验研究中常用到的PNS提取、分离纯化技术进行综述，为PNS的进一步研究及工业生产等提供参考。 [关键词]三七；三七总皂苷；提取技术；分离纯化技术 [中图分类号] R283.3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）07（c）-0019-05 [Abstract]Panax notoginseng saponins（PNS），as the main active ingredient of Panax notoginseng，which has a variety of pharmacological effects and clinical applications，and it is widely used in medicine，health products，cosmetic products and other industries.With the rising demand for PNS，extracting and separating and purifying technologies of PNS are particularly important.Currently，the studying on extractive， separative and purificative technology for PNS are especially more，considering its extraction rate，economy，large-scale production and other factors，using one of the first and formost method，which is the frequently-use method that of extracting and separating and purifying PNS from Panax notoginseng，firstly adopts the technique of ethanol refluxing extraction，then uses the method of macroporous resin adsorption to separate and purify PNS，and parts of them also combine with enzymolysis approach and alcohol precipitation approach to prepare PNS.In this paper，the commonly used techniques in laboratory research，which are the methods of extracting and separating and purifying PNS from medicinal material Panax notoginseng in recent years，are reviewed to provide the reference to the further studying on PNS and industrial production. [Key words]Panax notoginseng；Panax notoginseng saponins；Extractive technique；Separative and purificative technique 三七为五加科人参属植物三七（Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen）的干燥根，又称田七，古代称其为金不换，是我国传统名贵中药材，主产于我国云南文山和广西，目前多用其栽培品。其在《跌损妙方》《医门秘旨》《本草纲目》中均有详细记载，有止血、活血化瘀、消肿止痛等功效，其活性成分主要是三七总皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS）[1]。PNS具有滋补强身、调节免疫等作用，主要用于心、脑血管及循环系统。现代药理研究表明，PNS有强心、扩张冠状动脉、增加冠状动脉血流量、降低血小板表面活性、抑制血小板黏附和聚集、降低血液黏度、抗血栓形成及动脉粥样硬化等作用；对脑血管缺血缺氧损伤及脑缺血再灌注损伤有保护作用，能抑制神经细胞凋亡等[1-2]。随着社会的发展及人们生活水平的提高，越来越多的患者受心脑血管疾病的折磨，对三七、其主要有效成分PNS及其制剂的需求日益剧增。其相关研究也越来越深入、透彻。PNS疗效确切，临床应用广泛，如血塞通冻干粉针剂、软胶囊、片剂及血栓通注射剂等，其疗效和副作用受提取、分离纯化技术的影响很大。因此，本文将对近年来实验室研究中PNS的提取、分离纯化技术进行综述，为其进一步研究及工业生产提供参考。 1 PNS的提取方法 目前，PNS的实验室提取方法常用的有：水煎煮法、浸渍法、渗漉法、乙醇回流提取法、水解提取法、加压溶剂提取法、超声提取法、微波提取法、超临界CO2萃取法、闪式提取法、减压内部沸腾法、罐组逆流提取法及其他提取方法。 1.1水煎煮法 水煎煮法是以水为溶剂，煮沸提取出药材有效成分的方法。石凌云等[3]采用正交设计筛选出水煎煮法提取PNS的最佳条件为：提取3次，第1次料液比为1∶3，后两次料液比为1∶1，每次煎煮1 h。该方法提取率高，设备操作简单，经济环保，但溶剂难回收，PNS易受长期加热而被破坏。 1.2浸渍法 浸渍法是用极性溶剂浸泡提取出有效成分的一种方法。根据是否要加热，可分为：冷浸法和热浸法。 1.2.1冷浸法 冷浸法是在常温下用溶剂浸泡药材提取出其有效成分的方法。Dong等[4]以PNS各组分含量为评价指标，采用正交设计优化出冷浸提取的最佳条件为：溶剂为水，料液比为20∶1（g/ml），冷浸24 h。该法所需溶剂和时间较多，经济成本高，不常用。 1.2.2热浸法 热浸法是在加热的条件下，用极性溶剂浸出药材有效成分的方法。刘旭等[5]比较渗漉法、乙醇回流法、热浸法及超声法对PNS提取率的影响，结果表明，热浸法得到的PNS含量较高，用正交设计筛选出热浸法提取PNS的最适宜条件为：溶剂为80%乙醇，料液比为1∶12（g/ml），温度为65 ℃，提取160 min。该法与冷浸法相比，提取效率高、耗时短，但长时间加热保温，PNS受热易影响其活性。 1.3渗漉法 渗漉法是在常温下，用溶剂在一定的流速下渗漉出药材有效成分的提取方法。谭朝阳等[6]采用正交设计优选出其最优条件为：溶剂为50%乙醇，料液比为1∶12（g/ml），流速为1～3 ml/（minkg）。该法较其他传统提取法不需加热、耗能低，但溶剂消耗大，增加溶剂回收工作量及能耗。 1.4乙醇回流提取法 乙醇回流提取法是在加热条件下，用回流技术提取药材有效成分的一种常用提取方法。相关研究[7-8]以PNS提取率为评价指标，经实验设计筛选乙醇回流提取法提取PNS的最佳条件：溶剂为75%乙醇，料液比为1∶6（g/ml），提取4次，0.5 h/次。该法操作简便，重现性好，提取率高，溶剂易回收，经济环保，综合了水煎煮技术、浸渍技术及渗漉提取技术，是目前最常用的中药材提取方法。 1.5水解提取法 水解提取法是将药材经酸或酶处理提取出其有效成分的一种方法。根据处理方法不同分为：酸水解法和酶水解法。 1.5.1酸水解法 酸水解法是用酸处理辅助提取出有效成分的方法。相关研究[9-10]用酸处理三七根，得到了一系列三七皂苷，包括原人参二醇型（PPD）、原人参三醇型（PPT）等三七皂苷。马银海等[11]采用正交设计确定酸水解提取PNS的最佳条件为：pH值约为4，料液比为1∶12（g/ml），煎煮2次，2 h/次，经HPD-100树脂处理得到PNS浸膏收率达10.8%左右。该方法操作简单，提取率高，但PNS易受酸和热的影响而被破坏，因此不建议用于PNS提取。 1.5.2酶水解法 酶水解法是在提取前用适宜的酶处理药材，提取出其有效成分的一种方法。王莉等[12]研究表明：酶水解法较传统渗漉法大大降低了溶剂用量、能耗、时间及成本。宋宏新等[13]采用正交设计优选该法提取PNS的最佳条件为：温度为70℃，提取2.5 h，料液比为1∶10（g/ml）。该法提取效率高、经济安全，有较好的应用前景。 1.6加压溶剂提取法 加压溶剂提取法是在加压、加热条件下，用溶剂提取出药材有效成分的一种方法。吴丽霞等[14-15]对比了渗漉法、乙醇回流法、超声法、加压提取法提取PNS的收率，加压溶剂法得到的收率较高，且正交设计筛选其工艺参数为：压力为4.5 kg/cm2，药材粒径为40目左右，温度为60℃，溶剂为70%乙醇，料液比为1∶10（g/ml），提取1 h。该法提取率高、操作可自动化，但需加压和加热，经济成本高，不适合大规模生产。 1.7超声提取法 超声提取法是利用超声技术提取药材有效成分的方法。丁艳芬等[16]采用正交设计筛选PNS的最佳超声提取条件为：溶剂为75%乙醇，频率为50 kHz，提取4次，0.5 h/次、温度为40 ℃，浸膏收率高达12%。该法操作简单、提取率高、重现性好、耗时短，但提取量低，可用于少量样品的制备。 1.8微波提取法 微波提取法是采用微波加热提取药材有效成分的方法。董彩玉等[17]研究了微波连续式与间歇式提取对PNS提取率的影响，结果表明，微波间歇式提取率高，其条件为：料液比为1∶100（g/ml），溶剂为60%乙醇，微波功率为340 W，提取6次，20 s/次。该法能耗小、耗时短、溶剂用量少，可用于实验研究中，有待开发用于大规模生产。 1.9超临界CO2萃取法 超临界CO2萃取法是利用超临界CO2萃取技术提取药材有效成分的一种高效、绿色的方法。李毛全等[18]采用正交设计筛选其最佳条件为：CO2流量为25 kg/h，压力为35 MPa，夹带剂为95%乙醇，萃取4 h，温度为55 ℃，解析釜Ⅰ、Ⅱ的压力和温度分别为8 MPa、45 ℃，5 MPa、40 ℃。该法萃取率高，耗时短，无溶剂污染，保持药材有效成分的原有纯正香气，所得样品色美质佳，因其对设备要求高，经济成本高，适用于提取贵重药材精油及挥发油等，对于PNS的提取待进一步研究。 1.10闪式提取法 闪式提取法是应用闪式提取器高速旋转破坏药材细胞壁，使其有效成分快速浸出的方法。相关研究[19-20]对比了闪式提取法、超声提取法、乙醇回流提取法对PNS提取的影响，结果表明：闪式提取法的提取率高于其他两种方法。该法操作简便，提取率高，提取速率快，有益于热敏物质的提取，是一种值得开发和推广的中药材提取新技术。 1.11其他方法 除上述方法外，还有一些不常用和辅助提取的方法，如减压内部沸腾法、罐组逆流提取法、BP神经网络优化法、空间设计法、索氏提取法等。李春玲等[21]优化减压内部沸腾法提取的最佳条件为：解吸剂为70%乙醇，溶剂为水，温度为45℃，压力为-0.084 MPa，解析剂与药材用量之比为1.6∶1，料液比为1∶20（g/ml），提取2次，4 min/次。该法提取效率高，适合提取热敏物质。陈勇等[22]采用正交设计筛选罐组逆流提取的最优条件为：溶剂为70%乙醇，料液比为1∶8，温度25～50℃，提取30 min，该法提取率较回流法、索氏提取法、超声法高，溶剂用量少，耗能低。杜雪岭等[23-24]采用BP神经网络及质量源于设计的理念结合空间设计筛选乙醇回流法的工艺条件，该法为实验提供可靠的数据，可用于实验前设计。Vongsangnak W等[25]研究了有机溶剂提取法、热回流提取法、索氏提取法、微波提取法、超声辅助提取法对PNS提取的影响，得出最佳提取工艺为：微波提取法，料液比为1∶150（g/ml），微波辐射功率为125 W，温度为50 ℃、提取4 min。这些方法由于操作复杂，在实际研究及生产中有一定限制，因而未被广泛应用。 2 PNS的分离、纯化方法 目前，PNS分离、纯化的实验方法有：醇沉法、膜分离法、双水相萃取法、离子交换纤维法、大孔树脂吸附法等。 2.1醇沉法 醇沉法是在水或乙醇提取液中加入乙醇除去多糖、蛋白质、树胶、氨基酸、黏液质等大分子物质而达到分离纯化目的的方法。袁旭江等[26]采用正交设计法优化出醇沉法的最佳条件为：料液比为1∶7（g/ml），溶剂为70%乙醇，提取2次，2 h/次，合并提取液，用70%、80%、80%乙醇进行醇沉。该法纯化率高，溶剂用量小，耗时短，成本低，可被广泛应用于实验和大规模生产。 2.2膜分离法 膜分离法是利用膜对不同分子量的物质进行截留而除去大分子等杂质的一种方法。根据膜孔径大小的不同可分为：陶瓷膜分离、超滤膜分离等。 2.2.1陶瓷膜分离 陶瓷膜分离是利用陶瓷膜能够截留一些微粒而达到纯化目的的一种方法。姜淑[27]研究了陶瓷膜对PNS的影响，结果显示：经微滤后，部分颗粒杂质被除去，有效成分有损失，但其含量提高。该法是去除固体微粒的新技术，有很好的开发前景。 2.2.2超滤膜分离 超滤膜分离是利用超滤技术除去大分子物质的一种方法。陈彤等[28]通过小试及中试研究了超滤膜对PNS的影响，对超滤液进行可见异物检查，结果表明：截留分子量为100 KD的卷式超滤膜能去除部分大分子物质，降低滤液中可见异物，提高澄明度及含量。该技术可除去一定热源、蛋白质、内毒素等大分子物质，可用于注射剂生产，降低药物的不良反应发生率。 2.3双水相萃取法 双水相萃取是利用物质在两相中分配系数的不同而达到分离纯化的目的。谢涛等[29]以PEG-K2HPO4为萃取体系，研究了其对PNS萃取率的影响，最佳萃取条件为：PEG分子量为4000，pH值4.2～5.0，浸提液与萃取剂比例为1∶2，PEG与K2HPO4的质量比为1∶1。该法萃取率高、操作简单、耗时短、耗能低、经济成本低，适合大规模生产。 2.4离子交换法 离子交换法是利用离子交换纤维具有离子交换作用而进行分离纯化。范云鸽等[30]用阴阳离子串联交换树脂对PNS进行脱色，脱色率高达90%。崔成民等[31]采用正交设计筛选离子交换纤维纯化PNS的最优条件为：PNS在1.152 mg/ml的浓度下，静态吸附温度为65 ℃，pH值为8，浸提液与纤维用量比为250∶1（ml/g），吸附率达到91.02%左右；静态解吸pH值为1，温度为60 ℃，解吸剂为60%乙醇，解吸剂与饱和纤维用量之比为900∶1（ml/g），解吸率达到92.21%左右。该技术操作简便，研究甚少，待进一步研究应用于生产。 2.5大孔树脂吸附法 大孔树脂法是利用大孔树脂对不同物质的吸附能力不同达到分离纯化的目的。刘睿等[32]研究了AB-8、D380、G821三种树脂对PNS纯化的影响，结果表明：G821型树脂，3倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用2倍柱体积70%乙醇洗脱。Wan JB等[33]研究了D-101、DA-201、DM-301、DS-401四种树脂对PNS纯化的影响，优选最佳工艺为：DS-401型大孔树脂，30%乙醇对三醇型皂苷的洗脱能力强；80%乙醇对二醇型皂苷的洗脱能力强。该法操作简单、纯化率高、经济，是实验研究中常用的技术。 2.6其他方法 除上述技术外，研究中还用到硅胶柱色谱、半制备色谱、葡聚糖凝胶等方法。相关研究[34]用正、反相硅胶及交联葡聚糖LH-20对PNS进行分离纯化。Han LF等[35-36]用空间设计法优化半制备色谱纯化PNS的工艺。该技术操作简便，分离得到的单体化合物较纯，分离能力强，常用于单体的分离。 3小结 PNS药理作用显著，临床应用广范，加之全球心脑血管疾病患者日益增加，使得其提取、分离纯化技术越来越重要。随着研究手段的不断发展，传统技术不能满足现代研究需要，因此需要开发方便、高效的新技术来改进PNS的提取、分离纯化工艺。不同技术均有其针对性和适用范围，在实际运用中应综合考虑，选择合适的方法或多种方法相结合，达到最佳效果。在新技术中，尤其是闪式提取法，能快速提取有效成分且不需要加热，可广泛用于实验研究中；半制备色谱技术，分离度高、操作简便，常用于单体化合物的分离；膜分离技术，操作简便，研究甚少，可除去微粒、大分子物质等，可用于中药注射剂生产，除去其中的可见异物及大分子物质，提高澄明度，降低注射剂不良反应发生率等。目前对PNS提取、分离纯化的研究甚多，但多在实验研究阶段，在生产中应用较少。在企业生产中，若产品工艺条件改变，需对其进行生物学评价及临床评价，经申请、注册、审批等流程才能够规模化应用，此过程复杂繁琐，耗时长，经济成本高。因此，今后需要进一步研究合理、能够带来更大效益的新型生产技术。 [参考文献] [1]李娟，王如锋，杨莉，等.三七皂苷类成分及对心血管作用的研究进展[J].中国中药杂志，2015，40（17）：3480-3487. [2]Wang XM，Wang SX，Hu LM.Neuroprotective effect of Panax notoginseng saponins and its main components[J].WJNS，2014，4（1）：12-17. [3]石凌云，黄勇，郑林，等.荭叶心通软胶囊中三七提取工艺研究[J].贵阳医学院学报，2012，37（6）：619-622. [4]Dong TT，Zhao KJ，Huang WZ，et al.Orthogonal array design in optimizing the extraction efficiency of active constituents from roots of Panax notoginseng[J].Phytother Res，2005，19（8）：684-688.
发表于 2018-8-18 20:18:53