[摘要] 目的 探讨膝骨关节炎（KOA）患者血浆和关节滑液中microRNA-365（miR-365）的表达水平及其临床意义。方法 选取2015年5月～2016年5月在西安交通大学医学院附属红会医院住院治疗的52例膝骨关节炎患者和43例膝关节半月板损伤患者作为研究对象，采用定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测患者血浆和关节滑液中miR-365的表达水平，并统计分析膝骨关节炎患者血浆和关节滑液中miR-365的表达水平的相关性。 结果 膝骨关节炎患者血浆、关节滑液中miR-365水平分别为（1.690.42）、（1.440.36），膝关节半月板损伤患者血浆、关节滑液中miR-365水平分别为（1.280.27）、（1.250.19），二者比较，差异均有统计学意义（P 0.05）。相关分析显示膝骨关节炎患者血浆中miR-365水平与关节滑液中的水平之间呈正相关（r=0.631，P 0.05）。 结论 膝骨关节炎患者血浆、关节滑液中miR-365水平增高，提示miR-365可能参与了膝骨关节炎的病理过程。 [关键词] 骨关节炎；微小RNA；血浆；关节滑液 [中图分类号] R684.3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）09（c）-0103-04 [Abstract] Objective To detect the plasm and joint synovia levels of microRNA-365 （miR-365） in the patients with knee osteoarthritis and explore their clinical significances. Methods 52 patients with knee osteoarthritis and 43 patients with knee joint meniscus injury in Hong Hui Hospital， Xi'an Jiaotong University College of Medicine from May 2015 to May 2016 were enrolled in the study. The plasm and joint synovia levels of miR-365 were detected by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR）. The relationships between the plasm and joint synovia levels of miR-365 in patients with knee osteoarthritis were analyzed. Results The plasma levels of miR-365 in the patients with knee osteoarthritis （1.690.42） were statistically higher than those in the patients with knee joint meniscus injury （1.280.27） （P 0.01）. Compared with the patients with knee joint meniscus injury （1.250.19）， the joint synovia levels of miR-365 in the patients with knee osteoarthritis （1.440.36） were statistically higher （P 0.01）. The plasm levels of miR-365 were positive correlation with joint synovia levels （r=0.631， P 0.05）. Conclusion The plasm and joint synovia levels of miR-365 increase in the patients with knee osteoarthritis. miR-365 may involve in the pathology of knee osteoarthritis. [Key words] Osteoarthritis； MicroRNA； Plasm； Joint synovia 膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种伴随疼痛和膝关节运动障碍的慢性退行性关节疾病，主要病理改变是膝关节软骨面的退行性变和继发性的骨质增生。原发性膝骨关节炎的发病原因目前尚不清楚，可能是多因素综合作用的结果，增龄、肥胖、劳损、创伤、关节先天性异常、关节畸形等诸多因素与原发性膝骨关节炎的发病有关[1-5]。膝骨关节炎无特异的治疗方式，主要是减少关节的负重和过度的大幅度活动，以延缓病变的进程[6-8]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一种长度为22个左右核苷酸的非编码单链小RNA，参与转录后的基因表达调控，在细胞分化、生物发育及各种疾病的发生发展过程中发挥重要作用[9-10]。研究表明多种miRNAs在骨关节炎中表达异常，在疾病的发生发展中发挥一定作用[11-16]，Xu等[17]通过体内外实验研究发现骨关节炎软骨细胞的miR-365的表达水平远远高于正常的软骨细胞。为了进一步研究miR-365在骨关节炎中的作用，本研究利用定量聚合酶链反应（transcription polymerase chain reaction， PCR）检测52例膝骨关节炎患者和43例膝关节半月板损伤患者血浆和关节滑液中miR-365的表达水平，旨在初步探讨miR-365在膝骨关节炎发生发展中的作用。 1 资料与方法 1.1 一般资料 选取2015年5月～2016年5月在西安交通大学医学院附属红会医院（以下简称我院）关节外科住院治疗的膝骨关节炎患者52例，其中男24例，女28例，年龄45～72岁，平均（61.2411.63）岁，所有患者诊断均符合1986年美国风湿病学会提出的诊断标准[18]，排除标准：合并肿瘤、自身免疫性疾病、类风湿关节炎、血液系统疾病、炎症性疾病及严重心肝肾疾病。同期在我院关节外科住院治疗的43例外伤导致的单纯膝关节半月板损伤患者为对照组，其中男20例，女23例，年龄40～67岁，平均（57.7110.36）岁，排除标准：合并骨关节炎、肿瘤、自身免疫性疾病、类风湿关节炎、血液系统疾病、炎症性疾病及严重心肝肾疾病。两组研究对象性别、年龄比较差异均无统计学意义（P 0.05），具有可比性。本研究获得医院伦理委员会的批准并得到所有研究对象知情同意。 1.2 试剂与仪器 miRcute miRNA提取分离试剂盒、miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒、miRcute miRNA 荧光定量检测试剂盒、内参照U6（CD201-0145）及miR-365（CD201-0367）引物均购自天根生化科技（北京）有限公司，高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司，紫外分光光度计购自美国Thermo Scientific公司，定量PCR仪购自美国ABI公司。 1.3 方法 1.3.1 样本采集 所有膝骨关节炎和膝关节半月板损伤患者均在治疗前空腹采集EDTA抗凝血5.0 mL，并在膝关节穿刺时采集关节滑液500 L。血液及关节滑液分别在室温下2500 r/min及3000 r/min离心10 min，分离上层血浆或关节滑液至EP管中，4℃ 12000 r/min再次离心10 min，分别吸取上清至新的EP管中，置于-80℃保存。 1.3.2 血浆及关节滑液中miR-365水平的检测 取200 L血浆或关节滑液，采用miRcute miRNA提取分离试剂盒提取总RNA，提取的RNA溶解于20 L DEPC水中，实验操作严格按照试剂盒说明书进行。利用紫外分光光度仪测定提取的RNA液的OD260、OD280值，二者比值在1.8～2.1范围的RNA为合格，可用于下一步的逆转录反应。利用miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒进行逆转录反应，20 L的逆转录反应体系包括2 L RNA、10 L 2miRNA RT反应缓冲液、2 L miRNA 逆转录酶、6 L无RNA酶水，逆转录反应条件：42℃ 60 min、95℃ 3 min，合成的cDNA放置于-20℃保存待用。采用内参照U6（CD201-0145）及miR-365（CD201-0367）引物及miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒进行定量PCR扩增，20 L PCR反应体系具体如下：10 L 2miRcute Plus miRNA Premix、0.4 L上游引物、0.4 L下游引物、1 L cDNA、2 L 50ROX Reference Dye、6.2 L双蒸水，PCR反应条件：95℃预变性15 min，94℃ 20 s、60℃ 34 s，共40个循环。每个样本的每个基因均设立3个复孔，扩增结束后自动获得循环阈值即Ct值，基因表达水平采用2-△△Ct进行分析，Ct=实验组Ct（目的基因Ct-内参基因Ct）-对照组Ct（目的基因Ct-内参基因Ct） 。 1.4 统计学方法 利用SPSS 16.0软件对所有数据进行统计学处理，计量资料采用均数标准差（xs）表示，两组比较采用t检验，计数资料比较采用 检验，膝骨关节炎患者血浆与关节滑液中miR-365水平的相关性采用Pearson相关法进行分析。以P 0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 膝骨关节炎与膝关节半月板损伤患者血浆、关节滑液中miR-365水平的比较 定量PCR检测结果显示：与膝关节半月板损伤患者血浆、关节滑液中miR-365水平比较，膝骨关节炎患者血浆、关节滑液中miR-365水平明显增高，差异有统计学意义（P 0.01）；膝骨关节炎患者血浆中miR-365水平明显高于关节液中的水平，差异有统计学意义（P 0.01）；而膝关节半月板损伤患者血浆、关节液中miR-365水平的差异没有统计学意义（P 0.05）。见表1。 2.2 膝骨关节炎患者血浆与关节滑液中miR-365水平的相关性 相关分析显示膝骨关节炎患者血浆中miR-365水平与关节滑液中的水平之间呈正相关（r=0.631，P 0.05）。 3 讨论 骨关节炎是多种原因引起的关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生，临床主要表现为缓慢发展的关节疼痛、压痛、僵硬、关节肿胀、活动受限和关节畸形等。X线表现为关节间隙变窄，软骨下骨质致密，骨小梁断裂，有硬化和囊性变，关节边缘有唇样增生，骨关节炎发病机制尚未完全清楚，增龄、肥胖、劳损、创伤、关节先天性异常、关节畸形等诸多因素与原发性骨关节炎的发病有关[1-5]。 在细胞核内miRNA前体在RNA聚合酶的作用下转录成pri-miRNA，然后由核酸酶Drosha裂解成pre-miRNA后转运至细胞质中，在核酸酶Dicer的作用下形成成熟的miRNA，miRNA主要通过与靶基因mRNA的3UTR结合导致靶基因降解或者抑制靶基因的表达，从而在转录后水平阻断靶基因的表达，在机体的细胞凋亡、细胞增殖、细胞分化及发育等生理过程中发挥重要调节作用。越来越多的研究证实miRNA参与了肿瘤性疾病、自身免疫性疾病、心血管疾病、神经系统疾病及其他疾病的病理过程[9-10]。近年来的研究发现miRNA参与了成骨细胞、破骨细胞及软骨细胞的增殖、凋亡及分化，在骨代谢、骨重建、类风湿关节炎及骨肉瘤等生理病理过程发挥重要作用[19-21]。国内外学者研究发现miR-16、miR-22、miR-34a、miR-146a等在骨关节炎组织中高表达，可能发挥促进骨关节炎作用，而miR-27b、miR-125b、miR-140等在骨关节炎中低表达，可能在骨关节炎过程中起保护作用[11-17]。 miR-365基因定位16p13.12，miR-365的功能非常复杂，目前对miR-365的研究主要是集中在恶性肿瘤，国内外学者研究发现miR-365在结肠癌、肺癌、肝癌、恶性黑色素瘤、儿童白血病、浸润性导管胰腺癌及胃癌等肿瘤组织或细胞系中表达异常，miR-365在不同肿瘤中可能发挥不同的作用[22-24]。Xu等[17]利用定量PCR检测发现发现骨关节炎患者软骨细胞miR-365的表达水平远远高于正常的软骨细胞，同时在大鼠的骨关节炎模型中得到了验证。外周循环的miRNA可以与蛋白结合成复合体，不易被RNA酶降解，可以非常稳定地存在，体液中miRNA的浓度较高，可以达到作为生物标志物的检测浓度，同时由于体液取材方便，miRNA是理想的生物标志物[25]。有学者利用定量PCR检测发现非小细胞肺患者血清中miR-365表达水平明显降低，与肺癌的转移及预后有关[23]。目前研究发现miR-16、miR-132、miR-146a、miR-155、miR-223等多种miRNAs在骨关节炎患者血浆或关节滑液中表达异常[26-28]。本研究采用定量PCR检测了膝骨关节炎患者和膝关节半月板损伤患者血浆和关节滑液中miR-365的表达水平，结果发现膝骨关节炎患者血浆、关节滑液中miR-365水平均明显高于膝关节半月板损伤患者（P 0.01），与Xu等[17]在骨关节炎的软骨细胞中的研究结果一致，研究结果提示膝骨关节炎的发病过程中患者血浆及关节滑液中miR-365的水平不断增高，可能在疾病的病理进程中发挥了一定的作用。研究还发现膝骨关节炎患者血浆中miR-365水平明显高于关节液中的水平，进一步的相关分析显示膝骨关节炎患者血浆中miR-365水平与关节滑液中的水平之间呈正相关，提示膝骨关节炎患者血浆、关节滑液中miR-365的来源可能相同，但有关miR-365的具体来源有待于进一步研究。由于膝骨关节炎患者血浆及关节滑液中miR-365可以稳定存在、浓度较高且与病理过程有关，可以作为膝骨关节炎的一种生物标志物。 综上所述，膝骨关节炎患者血浆、关节滑液中miR-365水平增高，血浆中miR-365水平与关节滑液中的水平之间呈正相关，提示miR-365参与了膝骨关节炎的发生发展过程，随着对miR-365在膝骨关节炎中的研究深入，miR-365有可能成为膝骨关节炎诊断、预后及治疗的新靶点。 [参考文献] [1] Haseeb A，Haqqi TM. 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发表于 2018-8-18 20:09:16