2018子宫颈鳞状细胞癌中Aurora—A、MCM7和HPV16 E7的表达及病理学分

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　宫颈癌是全球范围内的女性恶性肿瘤，其发生率仅次于乳腺癌，居第二位，目前国内每年有13万例宫颈癌新发患者，其占全世界总发生率的28.2%，成为威胁我国女性生殖健康和生命安全的恶性肿瘤[1-2]。宫颈癌的发生、发展是一个漫长的过程，因此宫颈癌及癌前病变的及早发现和有效防治对于避免其恶化和转移是至关重要的[3-4]。本研究通过对子宫颈鳞状细胞癌患者手术新鲜标本进行分析，拟探讨子宫颈鳞状细胞癌中Aurora-A、MCM7和HPV16 E7的表达及病理学情况，为更好地指导临床诊断子宫颈鳞状细胞癌提供可靠地理论依据，现将结果报道如下：　　1 资料与方法　　1.1 一般资料　　选取2013年2月～2015年4月浙江省湖州市德清县中医院（以下简称我院）病理科收集的手术切除宫颈新鲜标本90例作为观察对象，依据宫颈病变分级标准进行分组，正常：宫颈无典型增生；宫颈上皮内瘤变（CINⅠ）：宫颈轻度非典型增生，异型细胞局限于上皮层的下1/3区，CIN Ⅱ：宫颈中度非典型增生，异型细胞占上皮层的1/3～2/3，异型性比CIN Ⅰ明显；CIN Ⅲ：宫颈重度非典型增生，异型细胞占上皮层2/3以上，宫颈鳞癌：异型细胞达到上皮全层，出现病理性核分裂象。其中正常组20例，CIN Ⅰ组20例，CIN Ⅱ组15例，CIN Ⅲ组15例，鳞癌组20例，组织标本患者年龄36～51岁，平均（41.56.6）岁，各个标本均通过组织病理学证实，均没有通过化疗、放疗和免疫性治疗。20例宫颈鳞癌病理分级：低分化鳞癌6例，中分化鳞癌7例，高分化鳞癌7例。临床分期：Ⅰa～Ⅰb期：8例，Ⅱa～Ⅱb期12例。本研究中的患者均经相关医学伦理委员会批准，患者在知情同意情况下参与本项调查。　　1.2 方法　　1.2.1 仪器与试剂 主要仪器：德国蔡司Axio Lab A1显微镜，无锡朗珈PAS9000病理图像分析系统。主要试剂：兔抗人MCM7单克隆抗体（武汉博士德生物技术有限公司生产），1∶100 Anti-HPV16 E7兔源、多抗（北京博奥森生物技术有限公司），Aurora-A原液试剂（Abcam香港公司）。　　1.2.2 免疫组化方法观察Aurora-A、MCM7和HPV16 E7的表达情况 收集宫颈新鲜组织标本在10%福尔马林中浸泡进行组织固定，将宫颈组织从固定液中取出来之后，通过自来水冲洗24 h，依次浸入75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、100%乙醇，对标本进行脱水，然后依次移入二甲苯进行透明处理。在包埋模具中加入到液态石蜡，加盖液体石蜡，形成蜡块。将包埋好蜡块放置在切片上，促使切面和刀口保持平行，切片厚度为4 m，将切片放入恒温水箱，在切片表面褶皱自然展开之后保持其贴附在防脱载玻片上进行烘干。将防脱载玻片放在载片架上，放在60℃恒温箱进行烤片，烤片时间为45～60 min。将载玻片逐步加入二甲苯（Ⅰ、Ⅱ）、二苯（Ⅲ）进行脱蜡，每种试剂各需要15 min，随后逐步的放入无水乙醇（Ⅰ）、无水乙醇（Ⅱ）、无水乙醇（Ⅲ）、95%乙醇、85%乙醇进行水化，最后再放入蒸馏水冲洗5 min。将标本组织完全进入到PBS缓冲液进行漂洗3次，每次持续漂洗5 min。取800 mL柠檬酸缓液放至高压锅中进行加热，保持温度1700℃，等到锅底冒水气泡，将载玻片放到锅内加盖，排气后停止加热，加盖保持10 min，逐步冷却到常温状态下。修复之后标本组织放到PBS缓冲液进行漂洗3次，每次漂洗5 min。每张切片上滴加50 L的3%H2O2，保证对宫颈组织进行完全覆盖，在湿盒内室温下避光放置20 min，将内源性的过氧化物酶去掉，然后再用蒸馏水进行冲洗3遍。分别加入一抗，4℃冰箱孵育16 h，通过PBS液代替一抗作为阴性对照。孵育16 h，放入37℃温箱中进行复温45 min。PBS缓冲液进行漂洗3次，加入二抗，在室温下孵育20 min，PBS缓冲液进行漂洗3次，加入SABC试剂将宫颈组织完全覆盖，室温下孵育20 min。PBS缓冲液进行漂洗4次，滴加DAB混合溶液，室温下进行显色反应，通过显微镜观察，染色程度。将显色终止后的切片，蒸馏水浸泡，然后浸泡在苏木精进行细胞核复染，3～5 min，然后用自来水冲洗，在盐酸酒精溶液中浸泡2次，进行分化，在自来水下冲洗，促使其返蓝，保持切片湿润，通过光镜观察细胞核。将组织切片吹干，逐步放入乙醇进行脱水。二甲苯等进行透明处理，然后进行封片，通过图像采集系统对切片进行拍照采图。　　1.2.3 Aurora-A、MCM7和HPV16 E7结果判定标准 Aurora-A、MCM7和HPV16 E7在宫颈组织中的阳性表达均在细胞核中，均呈现棕黄色，空白阴性对照细胞不会显色。分别根据三者在宫颈不同病变组织中阳性细胞百分率和染色程度进行判定评价。每张玻片在高倍镜（400倍）下选择5个宫颈组织结构完整、染色背景清晰程度、阳性细胞最集中的视野进行观察，每个视野内分别观察100个细胞中阳性细胞数量，计算平均阳性率。阳性表达按照细胞着色程度进行评价，1分：细胞着色浅，稍高于背景颜色；2分：细胞着色，明显高于背景；3分：细胞着色强染，着色呈现深棕色。按照阳性细胞所占比例划分，0分：0阳性率10%；1分：10%阳性率50%；2分：阳性50%阳性率75%；3分：75%阳性率100%。两项分数相加进行分级：（-）：分数范围0～1分；（+）：分数为2分；（++）：分数范围3～4分；（+++）：分数5分[5-6]。　　1.3 观察指标　　观察Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白在不同宫颈病变中的表达情况；观察Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白表达在不同临床、病理分期的宫颈鳞癌组织中的表达情况；分析Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白与宫颈鳞癌病理分期的相关性。　1.4 统计学方法　　采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计数资料用率表示，组间比较采用2检验；采用直线相关分析进行变量间的相关性分析，以P  0.05为差异有统计学意义。　　2 结果　　2.1 Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白在宫颈不同病变中的表达情况　　鳞癌组Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白阳性表达率均高于正常组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组，差异均有统计学意义（P  0.05）。见表1。　　2.2 Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白表达和宫颈鳞癌临床病理情况　　Ⅱa～Ⅱb期宫颈鳞癌组织中Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白阳性表达率均高于Ⅰa～Ⅰb期宫颈鳞癌组织，低分化宫颈鳞癌组织中Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白阳性表达率均高于高分化、中分化宫颈鳞癌组织，差异均有统计学意义（P  0.05）。见表2。　　2.3 Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白和宫颈鳞癌病理分期相关性　　Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白阳性表达率均与宫颈鳞癌病理分期呈正相关（r = 0.305、0.306、0.304，均P  0.05）。　　2.4 Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白在宫颈鳞癌表达情况　　通过免疫组化法对标本进行检测，在高倍镜下宫颈鳞状细胞癌癌细胞核内均可见Aurora-A、MCM7和HPV16 E7的蛋白。见图1。　　3 讨论　　近年来随着宫颈癌患病率明显增高，尤其是年轻化趋势越来越明显，宫颈癌的早期诊断和有效治疗显得尤为重要。探寻准确的肿瘤标志物和治疗靶点，为指导临床治疗提供可靠的理论依据，并已成为目前研究的热点问题[7-8]。免疫组化法是通过抗原-抗体特异性结合的基本原理，通过特异性抗体标记显色剂发生显色，对组织或者细胞内抗原进行定性，甚至进一步进行定位、定性或者定量分析[9-10]。　　本研究通过分析我院病理科2013年2月～2015年4月收集的手术切除宫颈新鲜标本90例病理学情况，通过免疫组化法分别对Aurora-A、MCM7和HPV16 E7的蛋白表达情况进行检测。观察Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白在宫颈不同病变、不同临床病理的宫颈鳞癌组织中的表达情况，并分析Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白与宫颈鳞癌病理分期的相关性。结果表明，鳞癌组Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白阳性表达率均高于正常组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组，提示宫颈鳞癌Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白表达明显升高，可以用于正常人群和宫颈病变的鉴别。宫颈鳞癌Ⅱa～Ⅱb期Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白阳性表达率均高于Ⅰa～Ⅰb期，提示随着临床分期的变化，宫颈鳞癌Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白阳性表达率逐渐升高。宫颈鳞癌低分化患者Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白阳性表达率均高于高分化、中分化者，Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白阳性表达率和宫颈鳞癌病理分期呈正相关，提示Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白表达和宫颈鳞癌病理分期变化可能有着密切的关系，可以作为临床评价宫颈鳞癌病理分期的敏感指标。Aurora-A是Aurora激酶中的一种，属于调节中心体、微管功能的丝氨酸/苏氨酸激酶，其在正常生理状态下主要功能是对细胞分裂过程进行调节，保证G2/M的正常转变，中心体发生分离、成熟，纺锤体装配和稳定胞质分裂[11-12]。在上皮性恶性肿瘤中，如结肠癌、宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌等均有不同程度的表达，与恶性肿瘤预后不良密切相关，其往往在多种恶性肿瘤细胞系中有异常高表达，并且可以引起细胞非整倍体和中心体异常变化。动物实验表明[13-14]，在正常小鼠NH3-T3细胞中转染Aurora-A基因，可能造成裸鼠形成恶性肿瘤。有资料显示[15-16]，宫颈癌细胞株中Aurora-A的基因、蛋白水平均有异常高表达，提示Aurora-A过度表达可能属于宫颈癌发生过程中的早期事件。Aurora-A在细胞中的高度表达会对中心体形成扩增，造成中心体功能缺失，形成了多级别的纺锤体，Aurora-A促使微管聚集，造成中心体和胞浆异常分裂，从而形成纺锤体、微管动粒。研究表明[17]，Aurora-A可以调节mTOR信号通路、通过磷酸化对底物PP1、RASGAP和TPX2进行调节，从而抑制肿瘤的发生和发展变化。微小染色体维持蛋白7（MCM7）是启动DNA复制重要蛋白质，其和肿瘤发生、发展及恶化转移均有者密切的关系。MCM7其是MCMs蛋白家族中的一员，还包括MCM2、MCM3、MCM4、MCM5、MCM6，这些蛋白均具有相似的结构，相互之间可以形成多聚复合体，其可以参与DNA复制和延伸，具有解链酶作用，调控DNA复制。MCM7是连接细胞周期中进行多种调控机制的桥梁，与细胞增殖分化、肿瘤形成均有着密切的关系。有研究表明[18-19]，MCM7参加G1期和S期对细胞周期的调控，与细胞的生成、细胞增殖和肿瘤形成有着密切的关系。人乳头瘤病毒（HPV）在宫颈癌、癌前病变的发生、发展过程中有着始动因素作用。HPV属于双链DNA病毒，其具有亲肤和亲黏膜的特性，HPV亚型比较多，其中HPV16型属于一种高危险型人乳头瘤病毒，其是目前最常见的类型，约占高危险型人乳头瘤病毒的50%[20-24]。HPV持续存在会引起细胞出现各种不同的转化，从而最终发展成为癌，高危险型HPV合成的E5、E6、E7蛋白在体外实验过程中能够诱导细胞转化，在人体内也可能造成肿瘤发生和发展，因而又被称为致瘤蛋白。这些致瘤蛋白不仅保持高危险型HPV自身复制以外，还会对正常细胞进行相关性的调控，从而造成组织细胞发生异常性的增生、转化，病毒的持续性存在会造成CIN，最终引起癌变发生。HPV16 E7参与宫颈癌的机制比较复杂：①和野生型Rb蛋白结合，对Rb蛋白和转录因子E2F结合造成干扰，进而促使细胞生长严重失控；②消除TGF-对于C-myc启动子的遏制效果；③对P21活性造成直接或者间接的影响；④P170、P130、cyclin A、cyclin E、cyclin D、cdk2等不同的细胞增殖周期相关性因子相结合，造成细胞分裂周期紊乱。HPV16 E7蛋白对于HPV复制和转录活化状态可以直接反应，因而成为宫颈瘤变的生物标志物之一。　　综上所述，Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白在宫颈癌、癌前病变中具有重要的意义，各蛋白联合检测可以为宫颈癌诊断及预后判断提供可靠的理论依据。　　[参考文献]　　[1] Gambichler T，Breininger A，Rotterdam S，et al. 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