2018基于效应成分当量的黄连饮片调剂一致性研究

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[摘要]中药调剂是中药面向临床的最后一关，中药调剂的稳定性保证是中药临床疗效的关键。以临床功用为导向，建立基于效应成分当量的中药饮片质量评控，不仅能保证中药调剂的稳定性，更能关联药效的精准性。该研究选取黄连为模式药，结合课题组前期构建的黄连效应成分指数，建立关联药效的黄连效应成分当量，并根据不同规格黄连饮片的临床量取均一性和煎煮顺应性，研究不同规格黄连饮片的调剂一致性，用于指导黄连饮片规格优选和临床调剂。结果表明，效应成分当量能直观的表征规格、量取和煎煮波动对中药药效的影响；依据效应成分当量所筛选的黄连饮片，具有临床调剂均一性高，煎煮顺应性好，效应成分当量高的特点。效应成分当量能提高中药调剂一致性评控的临床关联性；依据效应成分当量研制的精标饮片具有质量好、剂量调节性强等优点，该饮片的研制能促进中药饮片向精准稳定的方向迈进。　　[关键词]黄连；调剂；效应成分当量；一致性　　中药调剂是影响中药临床应用的核心环节之一，调剂质量直接关系中医临床疗效[1]，调剂均一性是中医疗效稳定的保证。中药调剂包括了从药材到饮片或中成药调配给患者使用的全过程，调剂的一致性，受饮片规格、炮制、量取、煎煮、配伍等多种因素影响[25]，如何在复杂的中药调剂影响因素中寻找一条以临床疗效为导向的中药调剂一致性评控，对中药临床疗效的稳定发挥具有重要意义。　　笔者在实验组前期构建的基于化学成分分析和生物效应检测，关联效应的综合质控指标效应成分指数的基础上[67]，引入效应成分当量的概念（系指在标准煎煮工艺下，一定剂量单味药物煎煮汤剂的效应总量），综合考虑量取和煎煮对中药调剂的影响，建立了一种关联临床的综合量化集成的中药调剂一致性评控，该方法以煎煮终点的样品为研究对象，从饮片使用的最终环节，统一度量饮片效应当量的高低，为饮片质量的优劣和中药调剂的一致性评控提供参考。效应成分当量高，饮片质量好，效应成分当量稳定性好，中药调剂一致性好。　　1材料与方法　　1.1材料与仪器　　Agilent1200高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；G1315DDAD紫外检测器（安捷伦科技有限公司）；AgilentChemStation色谱工作站（安捷伦科技有限公司）；BP121S电子分析天平（1/10万，德国Sartorius公司）；SYNER6Y超纯水机（MILLIPORE）。　　盐酸药根碱（批号131023），盐酸表小檗碱（批号130413），盐酸黄连碱（批号130430），盐酸巴马汀（批号140221），盐酸小檗碱（批号131128）均购自成都普菲德生物技术有限公司，纯度均98%；HPLC级甲醇和乙腈（美国Fisher公司）；娃哈哈纯净水；其余试剂均为分析纯。　　黄连药材由盛实百草药业有限公司提供，经解放军302医院肖小河研究员鉴定为毛茛科植物黄连CoptischinensisFranch.的干燥根及根茎。　　1.2含量测定　　1.2.1样品的制备黄连药材主茎、须根及药材中包裹杂质的分离：从同一批黄连药材中取7份等量的黄连药材，将药材的主茎、须根和其中包含的杂质分离，分别称量。　　不同规格和粒度黄连饮片的制备：取重庆黄水黄连基地的黄连药材6份，4份用于片型黄连饮片的切制，按照饮片切制规程，分别切制为1～2mm的顺片、斜片、横片和去须根横片；2份用于粉碎，根据2010年版《中国药典》对粉末的分等[8]，分别制得粗粉和细粉。　　不同规格和粒度黄连饮片煎煮不同时间点样品采集：取不同规格黄连饮片，每种规格3份，每份10g，精密称定，加10倍蒸馏水，浸泡30min，每份用移液管精密量取1mL溶液备用；然后用电热套，进行回流提取，并分别于15，30，45，60min，用移液管精密量取1mL溶液备用。　　1.2.2对照品溶液的制备精密称取盐酸药根碱等5种生物碱对照品适量，置于同一量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。得到盐酸药根碱8.73mgL-1，盐酸表小檗碱25.00mgL-1，盐酸黄连碱36.96mgL-1，盐酸巴马汀26.61mgL-1，盐酸小檗碱98.58mgL-1的混合对照品溶液。　　1.2.3供试品溶液的制备黄连药材主茎和须根供试品溶液的制备：参照2010年版《中国药典》黄连药材的供试品制备方法进行[8]。　　不同规格和粒度黄连饮片煎煮不同时间点供试品溶液的制备：精密量取不同规格和粒度黄连饮片煎煮不同时间点采集的样品200L，分别置于10mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。　　1.2.4色谱条件KromasilC18分析柱（4.6mm250mm，5m），流动相A为乙腈（1.5g十二烷基硫酸钠/500mL）水（2∶1）（磷酸调pH6.0），流动相B为磷酸二氢钾水溶液（每500mL水含磷酸二氢钾3.0g），检测波长345nm，柱温为30℃，流速1mLmin-1，流动相AB（60∶40），进样量10L。　　1.2.5方法学考察线性关系考察：精密称取对照品适量，加入甲醇配制成盐酸药根碱8.73mgL-1，盐酸表小檗碱25.00mgL-1，盐酸黄连碱36.96mgL-1，盐酸巴马汀26.61mgL-1，盐酸小檗碱98.58mgL-1的混合对照品溶液。在上述色谱条件下，分别进样1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0L，记录色谱图。以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。　精密度试验：精密吸取上述混合对照品溶液10L进样，连续进样6次，计算对照品峰面积RSD。　　稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液10L，分别于配制后0，2，4，6，8，12，24h进样，记录峰面积，测得各对照品峰面积的RSD。　　重复性试验：取去须根横片同一批样品6份，各约10g，精密称定，照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，依法测定并计算含量，计算盐酸药根碱，盐酸表小檗碱，盐酸黄连碱，盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的RSD。　　1.3不同规格黄连饮片效应成分指数随煎煮时间变化研究　　1.3.1黄连效应成分指数的构建黄连效应成分指数公式为课题组成员前期构建[6]，是一种基于化学成分分析和生物效应检测的综合质控指标，旨在解决目前黄连质控模式，以多指标成分对黄连质量进行监控，但指标成分彼此孤立，不同成分所关联的药效大小未有效表征，不能反映出不同成分对黄连药材整体药效的贡献度差异，等问题。黄连效应成分指数计算公式见公式（1）。　　Zm=100（0.331XBER+0.113XEPI+0.544XCOP+0.001XPAL+0.011XJAT）（1）　　式中Zm为不同规格黄连饮片的效应成分指数，XER，XEPI，XCOP，XPAL，XJAT分别为不同规格黄连饮片在不同煎煮时间点的盐酸小檗碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸药根碱含量。　　1.3.2偏最小二乘判别分析（PLSDA）采用SIMCAP+11.0版软件对6种规格，每种规格3个样品，合计18个黄连饮片样品的效应成分指数随煎煮时间变化的情况进行综合分析，考察不同规格黄连饮片煎煮溶出的总体差异，统计学参数采用软件默认。　　1.4不同规格黄连饮片量取均一性研究　　采用目前药房多采用的先精确称量总量，再依据目测法分付的操作方法。取上述6种规格的黄连饮片等量，每种规格分成10付，并分别用电子天平进行称量。分别计算此法量取每种规格黄连饮片质量的相对标准差。　　1.5不同规格黄连饮片煎煮终点效应成分当量一致性研究　　效应成分当量指在标准煎煮工艺下，一定剂量单味药物煎煮汤剂的效应总量。具体计算方法为效应成分指数乘以给药剂量，见公式（2）。　　EW=ZmM（2）　　式中EW为效应成分当量，M为给药剂量。　　用每种规格黄连饮片，按先精确称量总量，再依据目测法分付的操作方法分付的黄连饮片质量，乘以每种规格黄连饮片煎煮终点的效应成分指数，计算每种规格每次分付的饮片的效应成分当量值，每种规格分10付，做箱式图。比较不同规格黄连饮片在相同调剂条件下的效应成分当量值，及效应成分当量的一致性。　　2结果　　2.1须根对黄连饮片质量的影响　　同一批黄连药材中，取7份等量的黄连药材，须根及其包裹的杂质的质量占药材总质量的比例，相差较大，RSD45.70%，不利于饮片质量的稳定，分别取每份药材包含的主茎和须根适量进行含量测定，结果显示，须根中总生物碱占药材总生物碱0.50%以内，见图1。综上，结合含须根黄连药材易包裹各种杂质，会对饮片纯净度及外来有害物质控制带来影响，考虑黄连饮片去净须根。　　2.2含量测定方法学考察结果　　采用1.2.4项下条件，5种生物碱的色谱分离度均大于1.5，典型色谱图见图2。方法学考察结果，见表1。本实验所采用方法能够有效的将5种生物碱分离，分离效果好，方法操作简便，重复性好，可用于黄连药材和饮片5种生物碱成分含量的测定。　　2.3规格对黄连饮片生物碱煎煮溶出的影响　　按1.2项下含量测定方法，测定每种规格黄连饮片生物碱随煎煮时间的变化，每种规格平行测定3份，得到每种规格黄连饮片5个生物碱质量分数随煎煮时间变化的成分溶出曲线，为了更清楚的直观的表征，规格对饮片有效成分溶出及药效的影响，笔者引入课题组前期构建的，综合量化集成评控方法，效应成分指数，将生物碱质量分数随煎煮时间变化结果，带入1.3.1项中效应成分指数公式中，即得，不同规格黄连饮片效应成分指数随煎煮时间变化曲线，并运用偏最小二乘判别分析（PLSDA）对　　主茎与须根比较1）P0.01。　　曲线进行判别分析，结果见图3，4。由图可知，黄连饮片规格能影响生物碱的煎煮溶出效率，其中粉末状的饮片煎煮溶出状态不同于片型饮片，其中粗粉溶出效率优于细粉；4种片型饮片的溶出效率以去须根横片为优，其余3种片型饮片的煎煮溶出曲线差异无统计学意义；去须根横片与粗粉相比，溶出较慢但稳定性好，且煎煮终点的溶出效果优于粗粉。　　2.4不同规格黄连饮片煎煮终点效应成分当量一致性研究　　2.4.1不同规格黄连饮片量取均一性结果顺片、斜片、横片、去须根横片、粗粉和细粉分别按同样操作规程量取10次所得饮片质量的RSD依次为10.54%，6.97%，5.68%，1.47%，0.02%，0.01%。可以看出饮片规格越小，越利于调剂的均一性。　　2.4.2不同规格黄连饮片煎煮终点效应成分当量一致性结果按1.4项下操作方法，每种规格黄连饮片量取10次所得每付饮片质量乘以2.3项下每种规格黄连饮片煎煮终点的效应成分指数得到每种规格黄连饮片每付的效应成分当量值，做箱式图，结果见图5。不同规格黄连饮片，量取均一性不同，煎煮溶出效果也不同。效应成分当量的构建，使人们能从的饮片煎煮的终点观察量取和煎煮的波动对饮片药效稳定性的影响。自定义去须根横片具有相同剂量煎煮，效应成分当量高，均一性好的优点，便于临床疗效的稳定发挥。　3讨论　　中药调剂是影响中药临床应用的核心环节之一。中药饮片作为中药调剂的直接对象，其质量的稳定性，直接影响中药调剂的一致性。目前的饮片生产仍然处于一药数法，各地各法的状态[5]，市场上流通的饮片，质量参差不齐，商品等级混乱，以次充好现象普遍存在，然而现行中药质量标准多为单一、定性的指标，缺少定量化和系统化评判，并且与临床安全性和有效性以及用量等关联不密切[9]。构建关联临床的效应成分当量，能有效的度量饮片生产和调剂过程中各种因素对饮片药效的影响，利于高品质且质量稳定的饮片的生产和良好的调剂规程的建立，是保证中药调剂一致性的关键环节。本研究以黄连效应成分当量的构建和应用为例，阐释了效应成分当量指导精标饮片的规格优选，表征量取和煎煮波动对饮片药效稳定性的影响，以期为中药调剂一致性规程的建立提供方法参考；为中医精准用药，提供优质稳定的中药饮片。效应成分当量可以贯穿于中药调剂的各各环节，通过对过程一致性的评控，达到调剂终点的一致，或通过调剂终点的效应成分当量值，合理的调节给药量，同样达到调剂一致性的目的。效应成分当量高，饮片质量好，效应成分当量低，饮片质量差。饮片研制过程中，可以根据效应成分当量值优选饮片加工工艺。临床医生可以根据饮片效应成分当量值，合理调节给药剂量，以保证临床疗效的稳定。　　[参考文献]　　[1]翟华强，王燕平，金世元，等.中药调剂关键技术体系构建思考[J].中国中药杂志，2012，37（16）：2487.　　[2]王伽伯，刘斐斐，夏新华，等.中药调剂规范化研究（Ⅰ）：大黄不同调剂处理的化学同质性及条件优选[J].中国中药杂志，2011，36（12）：1587.　　[3]刘斐斐，王伽伯，夏新华，等.中药调剂规范化研究（Ⅱ）大黄不同调剂处理的等效性比较及条件优选[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（15）：10.　　[4]孙彩华.中药调剂差错分析及质量管理[J].中药房管理，2014，25（35）：3357.　　[5]于江泳，余伯阳，钱忠直，等.加快编制《全国中药饮片炮制规范》，规范统一饮片炮制国家标准[J].中国中药杂志，2011，36（19）：2751.　　[6]熊吟，肖小河，鄢丹，等.综合量化集成的中药品质评控策略：中药效应成分指数[J].中草药，2014（1）：3.