2018基于DNA条形码的桑螵蛸基原动物鉴定研究

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　[摘要]市场调查与文献报道发现，螳螂目昆虫产的卵鞘大多作为桑螵蛸入药，而药典仅收载了3种螳螂的卵鞘，非药典品种的卵鞘入药由于未加评估可能影响临床用药安全，因此亟需研究其原昆虫，由于桑螵蛸是螳螂的卵鞘，形态学等方法无法直接判断其基原，基于DNA条形码技术在动物分类研究中广泛应用，在中药鉴定中也愈发重要。研究首次利用DNA条形码技术，获得了市售桑螵蛸的COI序列，分析了其遗传距离，并构建系统发育树，准确区分了桑螵蛸的种类和原昆虫，证实了大刀螂Tenoderasinensis和巨斧螳螂Hierodulapatellifera分别为团螵蛸和黑螵蛸的基原昆虫，小刀螂Statiliamaculate和薄翅螳螂Mantisreligiosa均为长螵蛸的原昆虫。　　[关键词]桑螵蛸；基原鉴别；螳螂；DNA条形码　　桑螵蛸为螳螂目昆虫大刀螂TenoderasinensisSaussure、小刀螂StatiliamaculateThunberg和巨斧螳螂HierodulapatelliferaServille所产卵鞘，对应团螵蛸、长螵蛸、黑螵蛸，为临床常用中药，具有固精缩尿，补肾助阳的功效[1]。通过对桑螵蛸的本草，文献考证及前期市场调查发现，桑螵蛸原昆虫远不止药典收载的3种[23]。非药典品种的卵鞘入药由于未加评估可能影响临床用药安全，因此亟需研究其原昆虫。目前尚无有效的方法直接鉴定桑螵蛸的原昆虫。DNA条形码技术由于不受样品形态特征和发育阶段的影响，在动物分类工作中发挥了重要的作用，近年来在中药鉴定中越来越受到重视[46]。本研究首次采用DNA条形码技术获得了市售桑螵蛸的COI序列，明确了部分桑螵蛸与原昆虫的对应关系，为该技术在中药鉴定中的应用奠定了基础。　　1材料和方法　　1.1样品本文所用样品均经成都中医药大学国锦琳教授鉴定，凭证样品保存于成都中医药大学中药材标准化教育部重点实验室，3种桑螵蛸根据形态的差异认为区分为19类，样本信息见表1。　　1.2DNA扩增及测序参考蒋超等[7]碱裂解法并稍加改动快速提取桑螵蛸总DNA。COI通用引物、PCR反应体系及扩增程序参考Hebert等[8]的研究。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，送至英潍捷基（上海）有限公司进行双向测序。　　1.3数据分析采用CondonCodeAlignerV5.1.4进行拼接，并辅以人工校对。基于非脊椎动物线粒体遗传密码子，在MEGAV5.0中将COI序列翻译为氨基酸，以确认基因片段的正确性。同时将测定序列在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上运行BLAST程序进行序列同源性检索，用DNAMANV8.0进行同源性比较。　　运用MEGAV5.0软件进行多序列比对，基于K2P（Kimura2parameter）模型计算桑螵蛸种间及种内的遗传距离，采用NJ（neighborjoiningmethod）法[9]构建桑螵蛸和螳螂的系统聚类树。系统树各分支的置信度用自举检验法（bootstraptest）检验各分支的支持率，循环1000次。　　2结果与分析　　2.1COI基因的序列特性通过PCR扩增和测序，拼接，去除引物区后，获得长度为632bp的序列。在GenBank上进行BLAST相似性检索，结果表　　明所得序列均为螳螂目COI序列。采用MEGA5.0计算碱基组成，A，T，C，G碱基的平均质量分数分别为31.7%，35.5%，17.7%，15.2%，其中A+T的量明显高于G+C量，为典型的昆虫线粒体基因组碱基组成特征。所获得的桑螵蛸和螳螂COI序列已提交至GenBank，序列号见表1。　　2.2桑螵蛸原昆虫鉴定将所测序列在NCBI上进行BLAST相似性检索，结果显示，长螵蛸C4与薄翅螳螂Mantisreligiosa（登录号FJ802846）序列相似度在99%以上，表明薄翅螳螂M.religiosa为长螵蛸的原昆虫之一。利用DNAMAN软件进行同源性比较，结果发现，团螵蛸所有样品（T1～T7）与大刀螂T.sinensis、黑螵蛸3个样品（H6～H8）与巨斧螳螂H.patellifera、长螵蛸C2与小刀螂S.maculate的序列相似度均达到99%，表明巨斧螳螂H.patellifera和小刀螂S.maculate分别为黑螵蛸和长螵蛸基原昆虫之一，大刀螂T.sinensis为团螵蛸的基原昆虫。　　2.3系统发育分析基于COI序列，采用邻接法（NJ）构建19个桑螵蛸以及4种螳螂的系统发育树。所有样品可以分为6支，其中长螵蛸被分为3支：C1与C3（Clade2），C2与小刀螂S.maculate（Clade5），C4与薄翅螳螂M.religosa（Clade6）各聚为一支；黑螵蛸被分为2支：H1～H5聚为一支（Clade3），H6～H8与巨斧螳螂H.patellifera聚为一支（Clade4）；团螵蛸与大刀螂T.sinensis单独聚为一支（Clade1）。由此可见，本研究中长螵蛸有3类，即C1，C3为一类（长螵蛸a），C2，C4各为一类（长螵蛸b和c）；黑螵蛸有2类，即H1～H5为一类（黑螵蛸a），H6～H8为一类（黑螵蛸b），见图1。　　2.4桑螵蛸种间及种内的遗传变异在MEGA5.0软件中应用Kimura双参数法计算桑螵蛸种内和种间的遗传距离，结果见表2。6类桑螵蛸中，长螵蛸c的种内平均遗传距离最大（0.013），长螵蛸a的种内平均遗传距离最小（0.000）；长螵蛸a与长螵蛸b的种间遗传距离最大（0.177），团螵蛸和长螵蛸a的种间遗传距离最小（0.072）。种间平均遗传距离远大于种内平均遗传距离。　　从目前收集的样品研究表明，大刀螂T.sinensis和巨斧螳螂H.patellifera分别为团螵蛸和黑螵蛸的基原昆虫，小刀螂S.maculate和薄翅螳螂M.religiosa均为长螵蛸的原昆虫。　3讨论　　关于桑螵蛸的种类及其原昆虫问题，历代本草都记载多不一致。《中药志》[10]第4册记述桑螵蛸有3种，即团螵蛸、长螵蛸和黑螵蛸，为大刀螂T.sinensis、小刀螂S.maculate、薄翅螳螂M.religiosa和巨斧螳螂H.patellifera所产。1963年版《中国药典》未将桑螵蛸进行分类，原昆虫也收载了4种，即大刀螂T.sinensis、小刀螂S.maculate、薄翅螳螂M.religiosa和巨斧螳螂H.patellifera[11]。1977年版以后的《中国药典》认为3种桑螵蛸的基原昆虫分别为大刀螂T.sinensis、小刀螂T.sinensis和巨斧螳螂H.patellifera。《中华本草》[12]则记载3种桑螵蛸的原昆虫分别为大刀螂T.sinensis、南方刀螂Tenoderaaridifolia和巨斧螳螂H.patellifera。邓正已通过室内饲养和野外调查发现小刀螂S.maculate不是长螵蛸的基原昆虫，其所产卵鞘为短螵蛸，而长螵蛸的原昆虫应为南方刀螂T.aridifolia[13]。沈立荣研究证实团螵蛸的基原昆虫为大刀螂T.sinensis和南方刀螂T.aridifolia；黑螵蛸的基原昆虫为勇斧螳H.membranacea和巨斧螳螂H.patellifera；长螵蛸的基原昆虫有小刀螂S.maculate和绿污斑螳S.nemoralis[1415]。程地芸等则认为狭翅大刀螂T.augustipennis才是长螵蛸的基原昆虫，而非小刀螂S.maculate[16]。《中国螳螂目分类概要》[17]为桑螵蛸的分类提供了借鉴，但依然存在争议。由此可见现有文献报道中关于桑螵蛸与螳螂的对应关系不尽相同。桑螵蛸作为螳螂的卵鞘，从其外观形状直接鉴定原昆虫较为困难。DNA条形码技术极大的弥补了形态学分类鉴定的缺陷，因为每个物种的DNA序列是唯一的，不受个体形态特征和发育阶段的影响，可以完成形态学鉴定无法完成的工作，为形态难辨的生物提供更加准确可靠的鉴别手段。本研究首次利用DNA条形码技术对桑螵蛸进行了基原鉴定，应用分子生物学技术确定了部分桑螵蛸种类的原昆虫：大刀螂T.sinensis、小刀螂S.maculate和巨斧螳螂H.patellifera分别为团螵蛸、长螵蛸和黑螵蛸的基原昆虫，这与2010年版《中国药典》[1]一致，同时发现薄翅螳螂M.religiosa亦为长螵蛸的原昆虫，与部分文献报道一致[1011]，这将为桑螵蛸基原动物提供一种新的路径。从本研究结果来看，黑螵蛸和长螵蛸的原昆虫并非只有以上种类，由于原昆虫样本收集种类有限，还有待进一步研究与完善，本课题后续将进一步完善该工作。　　[致谢]感谢四川大学博物馆提供大刀螂、小刀螂和薄翅螳螂的准确鉴定标本。　　[参考文献]　　[1]中国药典.一部[S].2010：281.　　[2]沈立荣.浙江产三种螵蛸及六种原昆虫的鉴别检索[J].中药材，1994，17（12）：15.　　[3]温珑莲，万德光，任艳，等.不同类型的桑螵蛸与其基原昆虫对应关系研究[J].中国中药杂志，2013，38（7）：966.　　[4]陈士林，庞晓慧，姚辉.中药DNA条形码鉴定体系及研究方向[J].世界科学技术中医药现代化，2011，13（5）：747.　　[5]任保青，陈之端.植物DNA条形码技术[J].植物学报，2010（1）：1.　　[6]陈念，赵树进，韩丽萍.DNA条形码真菌鉴定技术[J].国际检验医学杂志，2008，29（8）：703.　　[7]蒋超，黄璐琦，袁媛，等.使用碱裂解法快速提取药材DNA方法的研究[J].药物分析杂志，2013，33（7）：1081.