2018植物源烟水和干馏液对栝楼种子萌发和幼苗生长的影响

850522

　[摘要]采用1∶500，1∶1000，1∶2000的烟水和干馏液处理栝楼种子，研究其对栝楼种子萌发和幼苗生长的影响。研究结果表明，不同浓度烟水和干馏液处理后，栝楼种子萌发率、萌发势和萌发指数这3项指标均显著增加，且1∶2000浓度处理增加幅度较大。随烟水和干馏液处理浓度的降低，栝楼种子淀粉酶活性升高；SOD活性无显著性变化；1∶2000浓度烟水和干馏液处理后，POD活性显著升高；CAT活性表现出显著的低浓度升高而高浓度降低的趋势；1∶1000和1∶2000浓度的烟水和干馏液处理显著促进栝楼幼苗的生长；随着烟水和干馏液浓度增加，叶绿素含量逐渐降低，但仍旧高于对照组。研究结果证实1∶2000浓度的烟水和干馏液可以促进栝楼种子萌发和幼苗生长，这为探索栝楼种子催芽技术提供了参考资料。　　[关键词]栝楼；烟水；干馏液；种子萌发；幼苗生长　　栝楼TrichosatheskirilowiiMaxim为葫芦科栝楼属多年生攀援藤本，具有清热化痰、宽胸散结和消肿排脓等功效[1]，除临床用药外，栝楼还具有较高的食用和保健价值，开发潜力巨大，种植面积逐年增加。栝楼的繁殖方式分为根段繁殖和种子繁殖。种子繁殖成本低，效率高，生产上多采用赤霉素催芽，赤霉素为人工合成品，成本高，污染严重，因此，亟需开展相关研究，开拓新型绿色催芽技术，这对于栝楼生产具有重要意义。　　植物源烟水是指植物焖烧产烟入水所得的水溶液，其生理生态作用已成为国际生态学界研究的热点[23]。大量研究表明烟水在打破种子休眠，促进种子萌发方面具有显著作用，如提高番木瓜、红米和野生燕麦等种子萌发[46]。近年来，国外烟水已产生大量高水平研究成果[78]，然而国内在烟水研究方面还非常薄弱，尤其将其用在中药材生产上更是凤毛麟角。干馏液是植物干馏所得的液体产物，目前被广泛用于医药杀菌、食品防腐和调味等领域。干馏液和烟水在制备工艺及化学成分上具有一定相似性，推测其在促进种子萌发方面也具有一定的生理生态效应。因此，本研究以栝楼种子为试材，研究不同浓度的烟水和干馏液对栝楼种子萌发及幼苗生长的影响，测定种子中淀粉酶活性、抗氧化酶活性以及幼苗中叶绿素含量等指标的动态变化，以期为探索栝楼种子催芽技术提供参考。　　1材料与方法　　1.1种子收集栝楼种子于2014年11月采自山东济南禾宝中药材有限公司中药材生产基地，经山东中医药大学张永清教授鉴定为葫芦科植物栝楼T.kirilowii，种子收集后于4℃储藏备用。　　1.2烟水和干馏液的制备烟水（smokewater，SW）的制备：收集落叶乔木一球悬铃木Platanusoccidentalis；二球悬铃木P.acerifolia；三球悬铃木P.orientalis枯黄的落叶各5.5kg，将其自然晾干后焖烧40～60min，燃烧所产生的烟通入500mL冷水中制得烟水母液[9]。将烟水母液与去离子水分别按照1∶500，1∶1000，1∶2000的体积比混合，即得烟水处理液：SW1（1∶500），SW2（1∶1000），SW3（1∶2000）。　　干馏液（DL）的制备：分别取山楂核Crataeguspinnatifida、酸枣核ZiziphiSpinosae和核桃壳Juglansregia各1.5kg，以质量比为1∶1∶1加入干馏釜中，加热至140～145℃，保温1h，继续加热至240～245℃，保温2h，然后温度升至300～360℃维持1h，收集各时段的干馏液母液[10]。将干馏液母液与去离子水分别按照1∶500，1∶1000，1∶2000的体积比混合，即得干馏液处理液DL1（1∶500），DL2（1∶1000），DL3（1∶2000）。　　1.3种子萌发和幼苗生长实验选取籽粒饱满、健康均一的栝楼种子，用10%H2O2消毒10min，然后蒸馏水冲洗3～4次，滤干。将消毒后的种子置于铺有2层滤纸的培养皿中，每皿40粒，5mL处理液/皿/48h，处理液分别为SW1，SW2，SW3，DL1，DL2，DL3，对照（CK）为等量去离子水，每个处理6个重复，置于人工气候培养箱中培养。培养条件：光强260～270molm-2s-1，14h光/10h暗，培养温度25℃，相对湿度65%～70%。每天记录种子萌发数目，以连续7d不再有种子萌发的时间作为种子发芽结束时间，计算种子的发芽率、发芽指数和发芽势。萌发实验结束时立即采用游标卡尺测定栝楼幼苗的根长和苗高，每个处理6个重复。　　种子发芽率=（G1+G2+Gt）/N，G为每天种子萌发的数目，N为供试种子总数。　　种子发芽指数=（Gt/Gt），Gt为第t天的种子发芽数目，Gt为相对应的种子发芽时间。　　种子发芽势=Gt/N，Gt为规定时间内种子的发芽数目，N为供试种子总数。　　1.4淀粉酶活性测定淀粉酶活性采用3，5二硝基水杨酸法测定[11]。称取1.0g栝楼种子于研钵中，加2mL水及少许石英砂，研磨成匀浆转入离心管中，用蒸馏水洗涤研钵后转入离心管中定容至10mL，放置20～30min，震摇3～4min，4000rmin-1离心15min，上清液转移至10mL量瓶中定容，即得粗酶液，用于淀粉酶活性的测定，每个处理6个重复。①取2支试管，1支测定管，1支对照管，每支试管分别加1mL酶液，70℃水浴15min，迅速冷却，对照管中加入2molL-1NaOH1mL，终止酶活性。②每管中均加入1mL0.1molL-1柠檬酸缓冲液，40℃水浴5min，加2mL40℃预热的淀粉，40℃水浴保温5min，取出后迅速向测定管中加入1mL2molL-1NaOH。③取对照管和测定管中溶液各1mL，分别加入到离心管中，各加入2mL3，5二硝基水杨酸，沸水浴加热5min，冷却，定容至12mL，混匀，以对照管作为参比溶液调零，测定520nm处吸光度。1.5抗氧化酶活性测定称取1.0g栝楼种子于研钵中，加5mLpH7.8的磷酸缓冲液（0.05molL-1），冰浴研磨成匀浆转入离心管中，定容至10mL，12000rmin-1离心20min，上清液转移至10mL量瓶中定容，即得粗酶液，用于抗氧化酶活性的测定，每个处理6个重复。①SOD活性采用核黄素NBT法[7]进行测定。取4支试管，2支为测定管，2支为对照管，对照管中加入3.2mL0.05molL-1pH7.8磷酸缓冲液，测定管中加入3.1mL0.05molL-1pH7.8磷酸缓冲液。4支试管中分别依次加入0.2mL1gL-1EDTANa2，0.2mL20gL-1L甲硫氨酸、0.2mL0.1gL-1核黄素、0.2mL1.0gL-1NBT。测定管中加入0.1mL酶液，各管溶液混匀后，把其中一只对照管放置在黑暗处，其余各管放于4000lx光下反应25min。以不照光的对照管为空白，分别测定其余各管在560nm下的吸光值。以每毫克蛋白质每分钟抑制光化还原50%的氯化硝基氮蓝四唑（NBT）为一个酶活性单位（U），酶活性以Umg-1protein表示。②POD活性采用愈创木酚比色法[8]进行测定。于试管中加入3.8mL0.3%愈创木酚（0.02molL-1pH6磷酸缓冲液配制），加100L3%H2O2，加100L酶液，立即计时，以每毫克蛋白质每分钟A470变化0.01为1个过氧化氢酶活性单位（U），酶活性以Umg-1protein表示。③CAT活性采用紫外吸收法[12]进行测定。取粗酶液50L，加入3mL0.05mLpH7.0磷酸缓冲液，再加入200L3%H2O2，迅速摇匀，立即计时。以每毫克蛋白每分钟A240减少0.01的酶量为一个酶活单位（U）表示，酶活性以Umg-1protein表示。　　1.6叶绿素含量测定取萌发后的栝楼种苗叶片约1.0g，精密称定。加丙酮5mL、少许CaCO3和石英砂，将栝楼幼苗叶片研磨成匀浆，80%丙酮转移匀浆至离心管中，1万rmin-1，4℃离心15min，取上清液定容至20mL，即为色素提取液。取色素提取液1mL，加80%丙酮4mL稀释后转入比色杯中，以80%丙酮为对照，分别测定663，645nm处的A[11]。　　叶绿素浓度=8.02A663+20.21A645　　1.7数据分析采用SPSS16.0统计软件进行数据处理，采用OnewayANOVA进行单因素方差分析，采用MicrosoftExcel软件绘图制表。　　2结果与分析　　2.1烟水和干馏液处理对栝楼种子萌发的影响烟水和干馏液处理对栝楼种子萌发的影响见图1。从萌发率来看，不同浓度的烟水和干馏液处理后，栝楼种子的萌发率显著升高，其中SW1，SW2，SW3处理后，种子萌发率较对照分别增加了32.1%（P0.05），25.8%（P0.05），38.4%（P0.05）；DL2和DL3处理后，种子萌发率较对照组分别提高了38.4%（P0.05），57.2%（P0.05）。从萌发指数来看，烟水和干馏液处理对其表现出与萌发率相似的效应，SW1，SW2，SW3处理后栝楼种子萌发指数分别高出对照31.6%（P0.05），25.3%（P0.05），37.8%（P0.05）；DL2，DL3处理后，种子萌发指数较对照分别升高37.8%（P0.05），56.6%（P0.05）。从萌发势来看，SW1，SW2，SW3处理后，种子萌发势较对照分别增加了16.3%，39.5%（P0.05），47.3%（P0.05）；DL2，DL3处理后种子发芽势分别升高47.3%（P0.05），78.3%（P0.05）。总的来看，烟水和干馏液处理后，栝楼种子萌发均受到显著的促进作用，而低浓度的烟水和干馏液处理对种子萌发的促进作用较显著。　　2.2烟水和干馏液处理对栝楼种子淀粉酶活性的影响烟水和干馏液处理对栝楼种子淀粉酶活性的影响结果见图2。SW1，SW2，SW3处理后，淀粉酶活性显著升高，分别高出对照6.74%，45.5%（P0.05），57.3%（P0.05）。DL1处理后，淀粉酶活性高出对照13.8%，然而随着DL浓度降低，淀粉酶活性逐渐升高，其中DL2和DL3处理后，淀粉酶活性与对照相比分别增加了29.2%（P0.05），57.3%（P0.05）。总的来看，低浓度烟水和干馏液处理能够显著增加栝楼种子中淀粉酶活性。　　2.3烟水和干馏液处理对栝楼种子抗氧化酶活性的影响烟水和干馏液处理对栝楼种子抗氧化酶活性的影响见图3。从SOD活性来看，不同浓度烟水和干馏液处理后，SOD活性与对照相比有所降低，但未达到显著性差异。从POD活性来看，SW3处理后，POD活性较对照升高了11.9%（P0.05）；DL2，DL3处理后，POD活性与对照相比分别增加了16.1%（P0.05），16.2%（P0.05）。从CAT活性来看，SW1，SW2处理后，CAT活性受到抑制，较对照相比分别降低了16.1%（P0.05），15.1%（P0.05），而SW3处理后，CAT活性却升高，高于对照7.5%（P0.05）；DL1处理后，CAT活性较对照降低了26.2%（P0.05），DL3处理后，CAT活性与对照相比显著增加了10.7%（P0.05）。总的来看，烟水和干馏液处理对SOD活性无显著性影响，而对POD和CAT活性影响较为显著，其中低浓度烟水和干馏液处理后2种酶活性显著升高。　　2.4烟水和干馏液处理对栝楼幼苗生长和叶绿素含量的影响烟水和干馏液对栝楼幼苗生长和叶绿素含量的影响结果见图4。从根长来看，SW2，SW3处理后，栝楼幼苗根长度显著增加，分别高于对照117.9%（P0.05），126.0%（P0.05）；DL1，DL2，DL3处理后，栝楼幼苗根长度分别较对照升高58.1%（P0.05），82.7%（P0.05），151.6%（P0.05）。从苗高来看，SW2，SW3处理后，苗高分别较对照提高44.3%（P0.05），48.8%（P0.05）；DL3处理后，苗高比对照增加99.4%（P0.05）。从叶绿素含量来看，与对照相比，SW1，SW2，SW3处理后叶绿素含量分别增加4.5%，20.3%（P0.05），27.3%（P0.05）；干馏液处理后，叶绿素含量表现出与烟水处理相似的变化趋势，DL1，DL2，DL3处理后叶绿素含量分别较对照增加9.9%（P0.05），12.9%（P0.05），20.6%（P0.05）。总的来看，中、低浓度烟水和低浓度干馏液能显著促进栝楼幼苗生长。　　3讨论　　近年来，烟水对植物的生理生态作用引起了国内外学者的广泛关注，目前已报道烟水可以促进80个属1200种植物的种子萌发和幼苗生长[1316]，并且这个数量还在随着研究的开展不断地增加，而目前国内研究甚少。干馏液是以天然植物为原料经高温干馏得到的烟熏液，早在20世纪90年代国外就将其作为食品调味剂。本实验以栝楼种子为研究对象，考察不同浓度烟水和干馏液对种子萌发和幼苗生长的影响。研究结果显示，烟水和干馏液处理后，栝楼种子萌发率、萌发势和萌发指数这3项指标均有所提高，其中1∶2000的烟水和干馏液对栝楼种子萌发的促进作用较显著。种子萌发初期需要消耗大量的能量，淀粉酶能加速大分子营养物质分解与转化，为种子萌发提供物质基础。本研究发现，烟水和干馏液对淀粉酶活性表现出与种子萌发率相似的　　生理效应，1∶2000的烟水和干馏液处理后淀粉酶活性显著升高，推测烟水和干馏液促进栝楼种子萌发可能与淀粉酶活性的升高有关。　　本研究中1∶2000烟水和干馏液处理的种子中POD和CAT活性上升幅度较大，提高了生物机体保护能力，维持细胞膜完整性，这在一定程度上为栝楼种子萌发提供了良好的环境。此外，还有学者认为，脂膜过氧化还可能会对叶绿素的合成产生抑制作用，导致胞内叶绿素含量降低[1718]。本研究中烟水和干馏液处理后，叶绿素含量的变化趋势与CAT活性变化相似，推测这一结果的产生可能与CAT对活性氧的清除作用有关。除了对种子萌发具有一定的促进效应外，烟水在提高植株幼苗生长方面也表现出显著活性，如烟水能促进弹簧草和野生大蒜幼苗生长[19]，显著增加洋槐植株枝条长度和根长[20]。本研究中烟水和干馏液处理后栝楼幼苗的根长和苗高都显著高于对照，这与其他学者的研究结果相吻合。优质的种子种苗是确保中药材产量和品质的关键环节，将植物源烟水和干馏液引入栝楼种子萌发，不仅生理生态效应显著，且制备方法简单易行、绿色无污染，可为开拓中药材种子绿色催芽技术提供基础资料。