2018贮藏时间对广金钱草种子质量的影响

7406321

[摘要]以广金钱草种子为材料，研究4℃贮藏条件下不同贮藏时间种子的发芽率、发芽势、千粒重、抗氧化物酶活性及种子浸出液电导率、可溶性糖、可溶性蛋白、淀粉含量的变化，以揭示种子劣变机制。结果表明：①随贮藏时间的延长广金钱草种子发芽率、发芽势、千粒重逐渐降低，种子颜色逐渐加深。②在种子发生劣变的过程中，SOD，POD活性变化趋势类似，均随贮藏时间的延长而降低。SOD活性在贮藏1095～1185d降低幅度最大，POD活性在贮藏365～395d显著降低。③种子浸出液的电导率、可溶性糖含量、淀粉含量随贮藏时间增加而增加，可溶性蛋白含量呈降低趋势。④对各项特征指标进行相关分析发现，广金钱草种子发芽率、发芽势、千粒重与SOD，POD活性呈显著或极显著正相关关系，与种子浸出液电导率、可溶性糖含量、淀粉含量呈极显著负相关关系。研究发现，在广金钱草种子贮藏过程中，种子抗氧化酶活性降低、浸出液电导率上升、可溶性糖和淀粉外渗及可溶性蛋白的降解等均是导致种子发生劣变的主要原因。　　[关键词]广金钱草；种子劣变；贮藏时间；生理生化　　广金钱草Desmodiumstyracifolium（Osbeck）Merr.为豆科山蚂蝗属Desmodium植物，以地上部分入药，有清热除湿、利尿通淋的功效[1]。目前，广金钱草野生资源日趋减少，人工栽培品已经成为药材的主要来源，人工栽培基地主要集中在广西、广东、海南等地[23]。生产上广金钱草以种子进行繁殖，因种子成熟期不一致、种皮硬实以及种皮颜色变化等因素的影响，广金钱草种子质量良莠不齐[4]。而优质种子是中药材高产和优质的重要前提和基础，种子达到生理成熟期时活力最高，随着贮藏时间的增加，活力逐渐降低，在这个过程中，发生了系列的生理变化，包括蛋白质、核酸、营养物质、生物膜等的变化，从而影响种子的质量[5]。本研究以种子活力、电导率、发芽率、过氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）等指标作为种子劣变程度的指标，分析广金钱草种子在不同贮藏时间内种子劣变规律，揭示4℃低温贮藏的广金钱草种子的生理变化，为广金钱草种子的生产及贮藏提供理论依据。　　1材料　　广金钱草种子于2010年购自广西玉林药材市场，经广东药学院杨全教授鉴定为广金钱草D.styracifolium的干燥成熟种子。种子包装于纸袋，贮藏于4℃冰箱。　　2方法　　2.1种子质量检测按《农作物种子检验规程》（中华人名共和国国家标准GB/T3543.1～3543.7）[6]进行。　　种子千粒重：随机选取自然风干种子1000粒称重，设3次重复。　　种子发芽率：以滤纸作为发芽床，每个培养皿均匀摆放100粒种子，放入光照培养箱（恒温25℃）进行培养，各设5次重复。10d为发芽期界限，胚根露出1mm为发芽。测定以下指标代表发芽活力。　　发芽率=[发芽数（第10天）/种子总数]100%　　种子发芽势=[发芽数（第5天）/种子总数]100%　　2.2抗氧化酶活性指标测定SOD活性参考李合生的方法测定[7]，POD活性参考deForchetti和Tigier的方法测定[8]。　　2.3生理特征指标测定电导率测定：取种子50粒用重蒸水冲洗3次，滤纸吸干表面浮水，装入试管中加入20mL双蒸水充分震荡后于25℃条件下浸泡24h，然后用DDSJ308A型电导仪（上海雷磁仪器厂）测定浸泡液的电导率EC值，每处理重复3次，计算单位种子质量的浸出液电导率[9]。　　可溶性蛋白含量用考马斯亮蓝G250比色法测定[10]，可溶性糖含量参考李合生的方法测定[7]。以上指标测定设6次重复，测定浸出液的含量。　　2.4统计分析方法采用SPSS17.0进行方差分析、差异显著性分析及相关性分析。　　3结果与分析　　3.1贮藏时间对广金钱草种子质量的影响随着贮藏时间的增加，广金钱草种皮颜色逐渐加深，千粒重、发芽率、发芽势逐渐降低，且差异达到极显著水平（表1）。其中，贮藏1～5d及贮藏365～395d的种子的种皮颜色以黄色居多，贮藏730～790d以黄褐色为主，1095～1185d深褐色比率最高。不同种皮颜色的千粒重表现为黄色黄褐色褐色深褐色绿色，以采收1～5d种子千粒重最高，较其他时间极显著高1.03～1.19倍（P0.01）。同时，种子发芽率、发芽势在贮藏后极显著降低，贮藏1095～1185d种子的发芽率较1～5d种子降低了260.7%，发芽势降低了123.2%。从种皮颜色来看，黄色、黄褐色种皮的种子发芽率、发芽势较其他颜色高。以上结果表明，随着贮藏时间的增加，种皮颜色加深，种子萌发能力减弱。　　3.2贮藏时间对广金钱草种子抗氧化酶活性的影响在贮藏过程中SOD，POD变化趋势相似，活性均随着贮藏时间的增加而逐渐降低，在贮藏1095～1185d时与1～5d种子达到显著差异，SOD，POD活性分别降低了39.2%，32.5%（P0.01）。而黄色，黄褐色种皮种子的SOD，POD活性明显高于褐色，深褐色，绿色种皮的种子（表2）。以上结果表明，广金钱草种子在贮藏过程中，特别是贮藏1095～1185d以后因SOD活性下降，其对种子中超氧阴离子的清除能力降低，而POD抗氧化活性也同时降低，从而对过氧化氢清除能力降低，引起过氧化氢的积累，产生了过氧化伤害，降低了种子的活力和发芽率。　　3.3贮藏时间对广金钱草种子生理指标的影响随着贮藏时间的增加，广金钱草种子浸出液电导率呈现出极显著增加的趋势（P0.01），贮藏730～790，1095～1185d种子分别是1～5d的2.69，　　3.98倍，从种皮颜色来看，深褐色种皮颜色种子电导率最高，其次是褐色、黄褐色、绿色、黄色种皮种子；随贮藏时间的增加，广金钱草种子浸出液中可溶性糖、淀粉含量逐渐升高，二者含量均表现为贮藏1095～1185d的种子极显著高于贮藏1～5，365～395d的种子，显著高于贮藏730～790d的种子；浸出液中可溶性蛋白含量逐渐降低，贮藏1095～1185d的种子极显著低于1～5，365～395d的种子，显著低于贮藏730～790d的种子（表3）。而从种皮颜色来看，浸出液可溶性蛋白含量随种皮颜色加深而降低，可溶性糖及可溶性淀粉含量均以褐色、深褐色含量较高。以上结果表明，随贮藏时间延长，种子发生了劣变，细胞膜受损严重，质膜透性增大，电导率增加，细胞内含物外渗增多，劣变种子较正常种子由于膜透性的增大从而损失更多的可溶性糖和淀粉；同时，种子发生劣变后可能由于过氧化作用，使细胞溶酶体受到破坏，加剧可溶性蛋白的降解，从而导致种子萌发率降低。　3.4抗氧化酶活性、生理指标与种子质量的关系通过对各项指标的相关性分析表明，种子发芽率、发芽势、千粒重与SOD活性、POD活性、可溶性蛋白含量存在显著或极显著正相关关系，与种子浸出液电　　导率、可溶性糖含量、淀粉含量呈显著或极显著负相关关系（表4）。说明随着广金钱草种子贮藏时间的延长，种子浸出液电导率随着种子抗氧化活物酶活力及种子质量的降低而升高，种子质量随着种子抗氧化酶活力的降低而降低。　　4讨论　　很多研究表明，种子的种皮颜色及贮藏时间与种子质量关系密切，魏建和等研究发现甘草绿籽种子活力高于黑籽[11]。侯茜等研究表明秦艽种子发芽率贮藏6个月明显高于12个月[12]。本研究发现，在贮藏1～1185d的过程中，广金钱草种皮颜色逐渐加深，贮藏1～5d的广金钱草种子种皮颜色主要是黄色、黄褐色、绿色，其中以黄色、黄褐色种皮的种子发芽率、发芽势、千粒重较高，贮藏365～790d后种皮颜色发生改变，绿色种子不见，出现褐色种子，1095d后黄色种子又消失，出现深褐色种子。李明等依据广金钱草发芽率、千粒重、含水量、净度、生活力将广金钱草种子质量分为3个等级[13]，而不同种皮颜色广金钱草种子质量存在差异，因此，有必要在广金钱草种子检验规程中补充种皮颜色，进一步完善广金钱草种子的质量分级标准。　　国内外对种子老化过程中SOD，POD活性的研究结果存在异同。本研究结果表明，广金钱草种子在贮藏过程中褐色、深褐色种子逐渐增多，SOD和POD活性不断降低，不能及时清除自由基，导致自由基发生积累，从而引起膜脂分子过氧化反应，细胞膜完整性遭到破坏，在一定条件下贮藏超过一定期限后，膜的结构和功能就会丧失，从而导致种子活力降低以至丧失，这也有可能是广金钱草种子贮藏过程中发生劣变的重要原因。　　细胞膜结构遭到破坏后，细胞内的可溶性离子的外渗性增强，导致种子浸出液电导率上升。本研　　究发现广金钱草随贮藏时间的增加，褐色、深褐色种子比率增大，种子浸出液电导率逐渐增加，表明细胞膜结构的改变，膜透性增大，从而使可溶性糖、淀粉发生流失，发芽率降低。　　广金钱草种子在贮藏过程中内部发生了系列的生理生化反应，最终体现在种皮颜色的改变。对各项指标的相关性分析为揭示种子劣变机制，探寻最佳贮藏时间提供可靠依据。本研究表明种子发芽率、发芽势、千粒重和SOD活性呈极显著正相关，和POD活性呈显著正相关关系，但SOD，POD活性和发芽率在不同贮藏时间间降低幅度不同，贮藏1095～1185dSOD活性迅速降低而发芽率下降幅度也最高，POD活性在贮藏365～395d时下降幅度较大，发芽率下降幅度却最低，说明相对POD活性而言SOD活性在保持广金钱草种子活力中发挥的作用更大。种子发芽率、发芽势、千粒重和电导率、浸出液可溶性糖及淀粉含量呈显著负相关关系，与浸出液可溶性蛋白含量呈显著正相关关系，说明电导率、浸出液可溶性糖、浸出液淀粉含量的升高、浸出液可溶性蛋白含量的降低是广金钱草种子活力降低的又一原因。种子活力的降低可能还有其他原因，需要进一步研究。　　综上所述，广金钱草种子在贮藏过程中发生的系列生理生化反应导致种子劣变，诸多因子的互作，影响了广金钱草种子的活性。　　[参考文献]　　[1]中国药典.一部[S].2010：43.　　[2]杨全，李淑渊，程轩轩，等.广金钱草资源调查与药材质量评价[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（3）：147.　　[3]杨全，卢挺，桑雪雨，等.不同种源地广金钱草药材质量变异与遗传多样性分析[J].中国中药杂志，2013，38（9）：1344.　　[4]唐晓敏，程轩轩，杨全，等.广金钱草种子萌发特性及种子硬实研究[J].种子，2014，33（3）：78.　　[5]颜启传.种子学[M].北京：中国农业出版社，2001：390.　　[6]国家质量技术监督局.中华人民共和国国家标准《农作物种子检验规程》（GB/T35431995）[S].北京：中国标准出版社，1995.　　[7]李合生.植物生理生化实验原理和技术[M].北京：高等教育出版社，2000：164.