2018宁夏枸杞内生菌抗氧化活性菌株的筛选与鉴定

3246676

　内生菌是指存活于健康植物组织内，而又不引发宿主植物出现明显感染症状的微生物类群[1]。植物内生菌在植物微生态系统中，与宿主建立了和谐的共生关系，不仅能够参与植物次生代谢产物的转化与合成，而且还能够独立产生丰富的次生代谢产物[2]；另外，内生菌易于发酵培养，可大量积累其有效活性代谢产物便于进一步工业化生产。目前，国内外学者已从红豆杉、长春花、桃儿七、银杏等多种药用植物中分离出具有多种生物活性成分的内生菌并广泛用于癌症、传染性疾病等的治疗和研究[35]，药用植物内生菌已成为人们寻找新型药物的重要来源。　　宁夏枸杞LyciumbarbarumL.为茄科、枸杞属多年生落叶小灌木，具有很高的营养价值和药用保健功效，其多糖含量高于同属其他种或品种[6]。宁夏枸杞因其药材品质在2000年被《中国药典》收录为道地性药材[7]。药用植物内生菌次生代谢产物含有与宿主植物相同或相似的药用活性成分，包括抗菌、抗炎症、降糖、抗氧化活性类物质等天然化合物[8]。由活性氧导致的氧化胁迫和氧化损伤是造成人体多种器官疾病和机体衰老的一个重要原因，而枸杞恰恰具有显著的抗氧化能力[9]；目前，对宁夏枸杞的开发应用主要集中在栽培育种技术以及枸杞多糖（LBP）的生物活性等方面，而关于宁夏枸杞内生菌代谢产物抗氧化活性的研究报道较少[10]。　　因此，本研究拟对宁夏枸杞不同发育阶段各药用组织器官中内生真菌、放线菌的抗氧化活性进行测定，并对抗氧化活性较强的菌株进行鉴定，旨在为开发新的抗氧化活性药物提供菌种资源，为揭示内生菌与道地药材之间的相关性研究奠定基础；同时为枸杞新品种的培育提供参考。　　1材料　　以宁夏枸杞主要栽培品种宁杞1号为供试材料，于2013年5月2014年7月在宁夏育新枸杞开发有限公司采用5点取样法从八年生健康枸杞植株采集不同发育期花、果、叶、根皮，表面消毒处理，备用。　　2方法　　2.1菌株的分离纯化将新鲜枸杞根皮、花、叶、果上杂物冲洗干净用滤纸吸干表面水份后，称取各组织材料各5g，在超净台中分别进行表面消毒处理，具体方法参考文献[11]。无菌处理后的各药用组织置于研钵中加入无菌生理盐水研磨至匀浆，取上清液梯度稀释后分别接种于高氏一号[12]和马丁固体培养基，置28℃下培养5～7d，观察平板上菌落的生长状况；同时取最后一次清洗各组织的无菌水涂布于平板，对表面消毒是否彻底进行验证。根据菌落形态挑选单菌落进行分离纯化，并依据纯化后菌落的培养特征和镜检结果进行归类、编号并转接于试管斜面保存备用。　　2.2内生菌发酵产物的制备将2.1中保存备用的内生菌发酵培养，各菌株分别接种于250mL的高氏一号和马丁液体培养基中，28℃，100rmin-1震荡发酵5～7d。发酵5～7d后的真菌与放线菌的菌悬液用8层纱布过滤后，8000rmin-1离心10min；上述各菌株的发酵上清液在55℃，60rmin-1用旋转蒸发仪旋蒸至黏稠状后用鼓风干燥箱在37℃烘干至膏状，4℃密封保存，备用。　　2.3总抗氧化能力的测定用总抗氧化能力测定试剂盒（南京建成）测定枸杞内生真菌和放线菌发酵产物的总抗氧化活性，参照试剂盒说明书依次操作进行测定，将2.2中所得内生菌膏状代谢物用无菌水分别配制成质量浓度为50gL-1待测样，无菌蒸馏水调零，用紫外分光光度计测定在520nm吸光度A，测定3个重复样品，每个样品重复3次，总抗氧化能力计算式如下：　　总抗氧化能力=（测定组A520-对照组A520）/0.01/30反应液总量/取样量样本测试前稀释倍数　　2.4羟自由基清除能力的测定采用羟自由基试剂盒（南京建成）来测定枸杞内生菌发酵产物羟基自由的清除能力；参照试剂盒说明书依次操作进行测定，将上述2.2中所得11株内生菌膏状代谢物用无菌水分别配制成质量浓度梯度为100，50，30，8，5，2，1.5，1gL-1待测样，无菌水调零，用紫外分光光度计测定在550nm各待测样吸光度A，每个样的不同梯度重复测定3次。根据各梯度清除率计算式样在清除率达到50%时的浓度（IC50），羟自由基清除率的计算式。 本文由提供，毕业论文 网专业代写教育教学论文和毕业论文以及发表论文服务，欢迎光临.cOm　　羟自由基清除率=（对照组A550-测定组A550）/对照组A550100%　　2.5菌株的分子鉴定将测试菌株分别接入高氏一号、马丁液体培养基中，28℃，100rmin-1振荡培养5～7d，4℃8000rmin-1离心收集菌体，以细菌基因组DNA提取试剂盒（北京天根）提取放线菌总DNA，采用SDS法提取内生真菌总DNA；选择通用引物对27F（5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3）/1492R（5TACGGYTACCTTGTTACGACTT3）和ITS1（5TCCGTAGGTGAACCTGCGG3）/ITS4（5TCCTCCGCTTATTGATATGC3）分别扩增放线菌16SrRNA序列和真菌ITS序列。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后，由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测序结果在GenBank中进行Blast比对，获得菌株序列同源性结果。　3结果与分析　　3.1内生菌的分离植物组织表面消毒后最后一次漂洗液涂布培养平板，28℃培养5～7d后未见菌落生长，说明表面消毒彻底。从各组织分离获得内生真菌18株；内生放线菌11株，果实中未分离出内生真菌和放线菌，具体分布特征见表1。结合培养特性和镜检结果，选择5株内生真菌和6株放线菌进行抗氧化活性的测定，菌株编号见表2。　　3.2抗氧化能力的测定采用总抗氧化试剂盒对11株内生菌进行总抗氧化活性的测定。结果表明，各菌株的发酵产物均有一定的总抗氧化能力，且真菌的总抗氧化活性和羟自由基清除能力强于放线菌。其中真菌菌株fL6，fL9总抗氧化能力最强，分别为（188.50.549），（113.631.021）UmL-1，高于阳性对照VitC（112.3UmL-1标准样），其余菌株总抗氧化能力相差不大。5株真菌的羟自由基清除能力普遍较强，其IC50均低于63mgL-1，且fL6与fL1的IC50远低于阳性对照VitC（IC50为14mgL-1）的浓度，分别为0.3，0.42mgL-1；而供试放线菌羟自由基清除能力均远低于阳性对照。各菌株总抗氧化能力和羟自由基清除能力结果见表2。　　3.3菌株的鉴定本研究对11株测试菌株进行分子鉴定；采用通用引物对27F/1492R和ITS1/ITS4扩增获得放线菌1120～1205bp和真菌499～529bp的单一条带，序列拼接校对后提交至GenBank，获得序列号，具体见表2。序列分析结果表明，抗氧化活性普遍较强的5株枸杞内生真菌分别与曲霉属Aspergillus、翘孢霉属Emericella和青霉属Penicillium的菌株序列同源性达到99%～100%，其中总抗氧化活性强的fL6，fL9和羟自由基清除能力强的fL1均隶属于曲霉属，6株放线菌隶属于微球菌属Micrococcus、微杆菌属Microbacterium、拟诺卡氏菌属Nocardiopsis。　　4讨论与结论　　生物体内源与外源性自由基均会导致机体氧化损伤，从而诱发各种疾病、促进衰老；目前，为保护生物体免受氧化损伤，寻找外源性的自由基清除剂和抗氧化剂已成为国内外学者的研究热点[1314]。本研究对分离自宁夏枸杞各药用组织的11株内生菌进行体外抗氧化活性测定，结果表明枸杞内生真菌的抗氧化活性强于内生放线菌，这与一些学者对杜仲、银杏、灯盏花等药用植物内生菌抗氧化活性研究结果相一致；同时，这些学者发现内生真菌的抗氧化活性物质主要为黄酮类[1517，4]；研究证实枸杞中枸杞多糖、黄酮、类胡萝卜素和VitC是枸杞中最主要的抗氧化活性物质[1820]，且李洋等[21]研究发现枸杞黄酮类物质在体外检测中对枸杞的总抗氧化能力的贡献率大于96%。Zhao等[22]从植物虎皮檀分离出一株具有强抗氧化活性的内生真菌Aspergillusfumigates，代谢产物中的活性成分主要为黄酮类化合物；而本研究中羟自由基清除率和总抗氧化能力较强的菌株fL6，fL9，fL1也属于Aspergillus，其代谢产物中的抗氧化活性物质是否含有枸杞黄酮或其类似物，值得进一步研究。　　在细胞的氧化反应中，超氧阴离子最先形成，并诱导其它自由基和氧化剂产生而损伤细胞，其中羟自由基的毒害作用最强[13]。本实验中fL6与fL1的羟自由基清除能力分别是阳性对照VitC的46倍和33倍，羟自由基清除能力明显强于目前已报道的多数内生真菌的能力，由此可知宁夏枸杞内生真菌具有潜在的开发应用前景。此外，菌株fL1，fL6分别与A.flavus，A.fumigatus同源性高达到100%，而在空气、土壤、植物表面中广泛存在的A.flavus与A.fumigatus分别是产黄曲霉毒素病原菌和播散性致病真菌[2324]，由此可见，对于处在不同生境中的微生物，由于生态环境的差异与宿主植物本身所产生的遗传变异，可导致内生菌代谢功能的差异。作为药食同源植物宁夏枸杞所具有的药用保健价值与其体内定殖的内生菌的关系、相互作用机制，及其内生菌代谢产物对其药用价值的影响都值得深入的研究与探索。　　[参考文献]　　[1]马旭闽，吴萍茹.植物内生真菌：一类生物活性物质的新的资源微生物[J].海峡药学，2004，16（4）：11.　　[2]KristinM，ChenQ，DanielS，etal.Culturableendophytesofmedicinalplantsandthegeneticbasisfortheirbioactivity[J].MicrobialEcol，2012，64（2）：431.　　[3]刘飞，伍晓丽，曾纬.桃儿七内生真菌的多样性研究进展[J].重庆中草药研究，2007，2（56）：39.　　[4]李佳，殷幼平，郑莉萍，等.柑橘黄龙病寄主长春花内生细菌的分离及功能鉴定[J].微生物学通报，2014，41（5）：862.　　[5]王梅霞.产黄酮类物质银杏内生真菌菌株的初步研究[D].南京：南京师范大学，2003. 本文由提供，毕业论文 网专业代写教育教学论文和毕业论文以及发表论文服务，欢迎光临.cOm　　[6]姚霞，许利嘉，肖伟，等.不同枸杞子中枸杞多糖的含量分析[J].医药导报，2011，30（4）：426.　　[7]中国药典.一部[S].2000：202.　　[8]马虎飞，王思敏，杨章民.陕北野生枸杞多糖的体外抗氧化活性[J].食品科学，2011，32（3）：60.