【摘要】 目的：探?乙型肝炎病毒（HBV）基因编码的X蛋白（HBx）与microRNA21（miR-21）在肝细胞癌HepG2细胞中的作用。方法：选取人肝癌细胞株HepG2细胞，随机分为HepG2细胞组、GFP腺病毒组和HBx腺病毒组，其中GFP腺病毒组和HBx腺病毒组细胞分别感染GFP腺病毒和HBx腺病毒，采用流式细胞仪检测各组细胞周期，Transwell检测细胞侵袭能力，Western blot检测ER蛋白表达，RT-PCR检测HBx mRNA和miR-21表达。结果：HBx腺病毒组HBx mRNA相对表达量为（0.805±0.030），明显高于HepG2细胞组和GFP腺病毒组（P http://
【关键词】 HBx蛋白； miR-21； 肝细胞癌； 增殖； 侵袭能力
【Abstract】 Objective：To investigate the role of hepatitis B virus（HBV） gene encoded X protein（HBx） and microRNA21（miR-21） in hepatocellular carcinoma HepG2 cells.Method：Human hepatoma cell line HepG2 was selected and randomly divided into HepG2 cell group，GFP adenovirus group and HBx adenovirus group，GFP adenovirus group and HBx adenovirus group were infected with GFP adenovirus and adenovirus HBx respectively，flow cytometry was used to detect the cell cycle，Transwell was used to detect invasion ability of cells，Western blot was used to detect the expression of ER protein，RT-PCR was used to detect HBx and miR-21 mRNA expression.Result：The relative expression of HBx and mRNA in HBx adenovirus group was （0.805±0.030），significantly higher than those in HepG2 cell group and GFP adenovirus group（P First-author’s address：The First Affiliated Hospital of Gannan Medical College，Ganzhou 341000，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.36.003
肝细胞肝癌是全球第六大常见的癌症，其致死率高居第三位[1]。乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）是一种17k Da的可溶性蛋白，同时存在于肝癌细胞的胞核和胞质内，是HBV相关肝癌形成的重要因素[2]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一种广泛存在于真核生物中的非编码内源性的单链小分子RNA[3]。miRNA具有高度保守性、时序性和组织特异性的特点，通过与靶基因3’非编码区结合，引起靶基因mRNA的降解或抑制靶基因mRNA的翻译，对生物体转录后的基因表达调控起关键作用。文献[4]研究表明，miR-21在肝细胞癌、非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤中异常表达，参与调控细胞增殖、凋亡、细胞周期分布等多个生物学过程。本研究拟通过将乙型肝炎病毒基因编码的X蛋白（HBx）感染肝癌细胞HepG2，以Real-time PCR检测miR-21表达变化，明确其在肝细胞癌HepG2细胞中的作用。
1 材料与方法
1.1 细胞培养 人肝癌细胞株HepG2购买自中国科学院细胞库，细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中，培养条件为37 ℃，5%CO2浓度，饱和湿度。
1.2 实验方法
1.2.1 腺病毒感染HepG2细胞 将指数期的HepG2细胞随机分为三组即HepG2细胞组、GFP腺病毒组和HBx腺病毒组。其中HepG2细胞组不做任何处理；以感染复数值200分别加入Ad/CMV-GFP及Ad/hTERT-GFP-Hbx转染HepG2细胞，分别为GFP腺病毒组及HBx腺病毒组，?D染后24、48、72 h收集细胞，进行后续检测。
1.2.2 Transwell检测细胞侵袭能力 将待测细胞制成细胞悬液，在每个Transwell小室中缓慢加入已配置好的细胞悬液100 ?L，下室小心加入10%FBS的培养基500 ?L，去除气泡，放入37 ℃，5%CO2培养箱，常规培养48 h。常规培养48 h后，弃去培养液，用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，甲醇固定15 min，以PBS清洗，0.1%结晶紫染色5～10 min，置于倒置显微镜下观察，拍摄和细胞计数。
1.2.3 流式细胞仪检测 收集待测的三组细胞各2×105个（包括上清），1 mL PBS室温下重悬。加入-20 ℃预冷的70%乙醇4 mL，混匀后-20 ℃静置过夜。1500 r/min，离心5 min，弃乙醇，5 mL PBS室温下重悬，水化15 min。1500 r/min，离心5 min，弃上清，避光条件下加入1 mL DNA标记液，室温下孵育30 min。1 h内以流式细胞仪检测细胞周期分布情况。
1.2.4 Western blot检测 提取待测细胞的总蛋白，以BCA试剂盒测定各组蛋白浓度。将各组蛋白与Loading buffer充分混合后100 ℃煮沸5 min，每孔50 μL加入到SDS-PAGE凝胶上样孔中进行电泳和转膜，5%脱脂奶粉37 ℃封闭。加入稀释后的待测一抗4 ℃过夜。TBST清洗后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（1∶1000稀释）。37 ℃孵育1 h，TBST清洗后以ECL发光液显影，自动凝胶成像系统采集图像，以GAPDH为内参。
1.2.5 RT-PCR检测 用Trizol法提取待测细胞的总RNA。反应条件为95 ℃ 30 s，（95℃
5 s，60℃ 34 s）×40循环，以ABI 7500实时定量PCR系统进行实验，收集荧光信号，并建立PCR产物的熔解曲线，重复三次实验，以2-average△△CT法分析比较。HBx引物序列：上游5’-TGTGAAGCTTATGGCTGCTAGGC-3’，下游5’-TGTGGAATTCTTAGGCAGAGGTG-3’；miR-21引物
序列：上游5’-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’，下游5’-GAATTTGCGTGTCATCCTTGCG-3’；内参U6引物序列：5’-GCTTCGGCAGCACATCTCATAAAAT-3’，5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。
1.3 统计学处理 统计分析采用SPSS 19.0软件，计量资料采用（x±s）表示，组间比较使用方差分析，两两比较采用LSD检验，以P0.05）。
2.2 各组HepG2细胞周期比例比较 各组HepG2细胞G2期细胞比例比较，差异无统计学意义（P>0.05）；HBx腺病毒组细胞G1期比例明显低于HepG2细胞组和GFP腺病毒组（P0.05）。见表1。
2.3 各组细胞侵袭能力比较 HBx腺病毒组穿膜细胞数为（78.12±8.78），明显高于HepG2细胞组的（53.11±8.90）和GFP腺病毒组的（55.02±9.21），差异均有统计学意义（P0.05）。见图2。 2.4 各组HepG2细胞miR-21和ER蛋白表达 HBx腺病毒组miR-21相对表达量为（1.892±0.038），明显高于HepG2细胞组的（0.981±0.034）和GFP腺病毒组的（0.948±0.041），差异均有统计学意义（P0.05）。见图3。
3 讨论
肿瘤干细胞（CSC）被认为是许多血液系统恶性肿瘤及实体肿瘤的来源[5]。目前已经逐渐认识到一部分的肝细胞肝癌（HCC）可能来源于发生了恶性转化的肝脏前体细胞。HBx起源的肿瘤被认为具有肝前体细胞表型，并且表现出更强的侵袭性[6]。3，5-二乙酯基-1，4-二氢可力丁（DDC）诱导可在肝脏内通过HBx促进人肝脏祖细胞的扩增和恶性转化，且在长期DDC作用下，HBx转基因肝脏可诱导形成混合型肝癌。这些结果不仅为肝前体细胞参与肝癌的形成提供了新的证据，也说明了HCC的发生发展可能与HBx过表达有关[7]。
在本研究中发现，HBx过表达可提高HepG2细胞S期细胞比例，降低G1期细胞比例，并且提高HepG2细胞的侵袭能力，说明HBx表达增加可促进肝癌细胞转移，这可能是因为HBx过表达使得肝前体细胞表型增加有关。HBx过表达可促使细胞内源性胞内信号通路改变，最终导致肝癌细胞恶性程度增加[8]。
随着对miRNA-21作用机制和功能研究的深入，miR-21与肿瘤的关系受到了越来越多的重视[9-11]。HCC是最常见的消化系统肿瘤之一，在世界范围内均具有较高的发病率和死亡率[12-14]。在大量的HCC病例的研究中，研究者们认识到HCC的发生发展过程中涉及到一系列HBx基因的改变等问题，但是HBx基因的表达受何种?C制调控还不明确。随着对miR-21的研究深入，发现miR-21的表达水平可能受到HBx调控，在HCC发生发展过程中发挥着重要的作用[15]。大量的基础研究证实miR-21可以直接促进细胞增殖、抑制细胞凋亡或促进细胞转移[16]。在HCC细胞中，miR-21还可靶向抑制Rb-E2信号传导通路，阻断G1/S期演进[17]。
本研究发现，HBx过表达时，miR-21表达增加，肝癌细胞G1期细胞比例降低，S期细胞比例增加，与文献[15-16]研究报道相一致。HBx过表达对肝癌细胞的促增殖和促转移作用可能是借由对miR-21的调控作用实现的。另外，雌激素受体α（ERα）在HBx过表达时蛋白水平明显降低，在临床组织标本的研究中发现，ERα低表达意味着肿瘤直径增加，更多的血管侵犯和更高的肿瘤恶性程度[18-20]，HBx可能借由调控ERα表达影响肝癌细胞的恶性程度[21]。但是，HBx对ERα的具体调控机制及其与miR-21的关系还需生物信息学分析及荧光素酶报告实验进一步探究。
本研究借由腺病毒转染构建了过表达HBx的HepG2细胞系，发现HBx过表达可增加S期细胞比例，降低G1期细胞比例，增加肝癌细胞侵袭能力，这种对细胞周期和细胞侵袭的调控作用可能是藉由miR-21表达升高和ERα蛋白水平降低实现的，在后续的研究中，还需进一步探究HBx与miR-21及ERα的调控关系和机制，并完善动物实验和临床组织标本研究证据。
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（收稿日期：2017-10-25） （本文?辑：张爽）
发表于 2018-8-18 00:15:12