2018河豚毒素的新国标与检测

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　　在中国古代人们便对河豚毒素的毒性有了深刻认识。晋人左思《三都赋?吴都赋》便有“王鲔?\鲐”之句，其注曰：“?\鲐鱼状，如蝌蚪，大者尺余，腹下白，背上青黑，有黄纹，性有毒。”沈括在《梦溪笔谈》中说：“吴人嗜河豚鱼，有遇毒者，往往杀人，可为深戒。”即便如此，河豚的鲜美仍使人趋之若鹜，所以长久以来就有“拼死吃河豚”的说法。随着科学技术的进步，人类可以运用检测手段来避免河豚毒素造成的伤害，而如何检测河豚毒素是防止人们中毒的重中之重。检测技术的改进，使得检测标准也有了变化。在由《食品安全导刊》、食安中国网共同举办的线上专题研讨会“食安大讲堂”中，美正生物运营总监伦丽丽围绕“河豚毒素检测技术”进行了详细的阐述。
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　　什么是河豚毒素？
　　河豚毒素是一种通俗的说法，其学名为河?毒素（TTX），是?鱼类（俗称河豚鱼）及其它生物体内含有的一种生物碱，也是自然界中所发现的毒性最大的神经毒素之一，曾一度被认为是自然界中毒性最强的非蛋白类毒素。TTX的毒性比氰化物高1250多倍，0.5mg即可致人丧命。TTX对肠道有局部刺激作用，吸收后会迅速作用于人的神经末梢及神经中枢，并可高选择性和高亲和性地阻断神经兴奋膜上的钠离子通道，阻碍神经传导，从而引起神经麻痹甚至死亡。
　　TTX是起源于生物体本身还是其寄生物尚有争议，因为河?毒素及类似物不仅存在于各种?科鱼类中，还广泛分布于各种高等、低等生物中。其他含有河?毒素的生物有一个共同点，即其体内含有多种能分泌毒素及其类似物的细菌，这些生物体内毒素的积累和分布因季节和部位不同而存在差异。
　　解读新国标
　　GB 5009.206-2016《食品安全国家标准 水产品中河豚毒素的测定》于2016年12月23日发布，2017年6月 23日实施，新标准规定了水产品中河豚毒素的4种测定方法。第一法为小鼠生物法，适用于河豚鱼肌肉、肝脏、皮肤和性腺组织中河豚毒素的测定。与旧有国标SNT 1569.2-2013《出口河豚鱼中河豚毒素检测方法 第2部分：小鼠生物法》相比，新国标样本的适用性更强，可用于检测河豚鱼的性腺组织。第二法为液相色谱串联质谱法，适用于河豚鱼肌肉、肝脏、皮肤和性腺组织中河豚毒素的测定。原标准中液相色谱串联质谱法是一种确认方法，而新国标中将此单独作为检测方法。第三法是液相荧光法，适用于河豚鱼、织纹螺、虾、牡蛎、花蛤和鱿鱼中河豚毒素的测定。以免疫亲和层析柱代替C18固相萃取柱进行提取净化，这两种方法代替了原有国标GB/T 23217-2008《水产品中河豚毒素的测定 液相色谱-荧光检测法》。第四法是酶联免疫吸附法，适用于河豚鱼肝脏、皮肤和性腺组织中河豚毒素的测定，本法代替了GB/T 5009.206-2007《鲜河豚鱼中河豚毒素的测定》，原有国标采用直接酶联免疫吸附法，而新版国标采用的是间接酶联免疫吸附法。
　　河豚毒素的检测技术
　　虽然新国标中规定了4种方法，但在实验室检测或市场监督检测时适用程度仍有不同，伦丽丽向听众介绍了3种适用性较强的方法―液相色谱串联质谱法、酶联免疫试剂盒法及胶体金快速检测法。
　　液相色谱串联质谱法：此方法的关键是前处理，首先称取2g样品，加入10mL 1%乙酸-甲醇溶液，涡旋振荡3min，然后放入40℃水浴中超声提取15min，待冷却至室温后，于6000r/ min的离心机中离心5min，从离心管中取7mL上清液加入28mL PBS溶液进行稀释，用适量的1N氢氧化钠溶液调整pH值至7左右。然后用玻璃微纤维滤纸过滤，除去杂质后移取其中10mL滤液，采用亲和免疫层析柱经过梯度洗脱的方式对滤液进行净化，使用免疫亲和层析柱时应注意上样液为中性环境（pH值7～8），上样时液滴流速控制在1～2滴/秒，洗脱液流速控制在1滴/秒。洗脱时建议加入2mL洗脱液，静置浸泡2min后再开始洗脱；当洗脱液超过柱容量时，因检测数据偏低待测物质将不能被有效捕获，可加大稀释倍数后再通过免疫亲和柱进行富集。进行色谱分析时，色谱柱一般采用规格为2.1×50mm，1.7μm的Amide柱，其流动相A为含0.1%（体积分数）甲酸的乙酸铵（5moL/L）溶液，流动相B为乙腈，流速控制在0.3mL/min，进样体积为10μL。以上为色谱分析流程，色谱分析过后再进行质谱分析，即完成此方法的全部流程。
　　酶联免疫试剂盒法：酶联免疫竞争法包括直接竞争法和间接竞争法。竞争法的原理为样本中的抗原和一定量的固相抗原竞争结合一定量的抗体，而后与酶标二抗反应，待测样本中抗原越多，与固相抗原结合的抗体及酶标二抗越少，显色越浅；反之，待测样本中抗原越少，显色越深。酶联试剂盒测定河豚毒素的含量分为两个部分，一是样品的测定，二是标准曲线的制作，两部分检测步骤相同。取2g样本，加入4mL提取液，提取5min，在4000rpm下离心10min。取上清液进行检测。检测步骤为加入标准品/样本50μL/孔到对应的微孔中，再加入酶标物50μL/孔，然后再加入抗试剂50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置于25℃避光环境中反应30min。揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250μL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用新枪头戳破）。加入底物液A液50μL/孔，再加底物液B液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15min使之显色。最后加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定每孔OD值。使用美正生物的酶联免疫试剂盒制作的标准曲?线性相关系数可达0.99以上，最低检出限可达4μg/kg，检测范围为4～324ppb。
　　胶体金快速检测法：此法与酶联免疫试剂盒法均为实验室快速检测方法。具体操作步骤为取3g样本，加入2mL试剂A，剧烈震荡5min，在4000rpm下离心5min，取1mL上清液加入10μL试剂B，混匀。取100μL混合液进行点卡检测，5min后即可对结果进行判读。消线法的检出限200μg/kg，比色法的检出限35μg/kg，此方法具有简单、快速、准确和无污染等优点。
　　美正生物
　　美正生物坐落于江苏省无锡市高新开发区，是一家专注于食品安全快速检测产品研发、生产、销售和服务的高科技创新企业。同时，美正生物为食药监系统、农业系统、畜牧系统、渔业系统、食品企业等提供专业的检测产品、先进的技术支持和高效的整体解决方案。美正生物始终坚持用最专业的产品、最优秀的团队和最完善的服务，服务于用户；始终坚持“试剂领先”的核心战略，坚持设备为实际检测服务的理念，为政府和企业提供全方位的食品安全检测技术和整体解决方案。