[摘要] 目的 建立人正常肝细胞株（L02）脂肪变模型，探讨软脂酸（PA）对肝细胞氧化应激的作用及羊栖菜多糖（SFPS）对脂肪变肝细胞氧化还原系统的影响。 方法 采用0.5 mmol/L的PA诱导L02细胞建立脂肪变模型，并予以不同浓度（25、50、100 μg/mL）SFPS进行干预。Annexin V-FITC标记法检测细胞的凋亡，MTT比色法检测细胞增殖活力，测定细胞内过氧化产物丙二醛含量（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）。 结果 SFPS可抑制PA对L02细胞增殖活性的下降和凋亡率的上升，降低MDA含量，升高SOD水平，不同浓度组间比较差异有统计学意义且具有剂量依赖性。 结论 L02细胞脂肪变性时发生明显的氧化应激，羊栖菜多糖能在一定程度上减轻氧化损伤、抗细胞凋亡。
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[关键词] 羊栖菜多糖；氧化应激；脂肪肝；软脂酸
[中图分类号] R575 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）34-0017-03
The occurrence of oxidative stress in L02 fatty model and the intervention of sargassum fusiforme polysaccharide
WU Limin XIA Shenglong SHEN Sujian XIA Xuanping XUE Zhanxiong JIANG Yi
Department of Gastroenterology， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000， China
[Abstract] Objective To establish a model of fatty degeneration in human normal liver cell line（L02） and to investigate the effect of palmitate（PA） on oxidative stress in hepatocytes and the effect of SFPS on the redox system of fatty liver cells. Methods L02 cells were induced by 0.5 mmol/L PA to establish a model of fatty degeneration， and were treated with different concentrations of SFPS（25， 50， 100 μg/mL）. Cell apoptosis was detected by Annexin V-FITC labeling method. Cell proliferation activity was measured by MTT colorimetric assay. Intracellular peroxide products including malondialdehyde（MDA） and superoxide dismutase（SOD） were measured. Results SFPS could inhibit the decrease of proliferation activity and apoptosis rate of L02 cells， decrease the content of MDA and increase the level of SOD， and the difference was statistically significant among different concentration groups and dose-dependent. Conclusions The oxidative stress occurs in the fatty degeneration of L02 cells. Sargassum fusiforme polysaccharide can alleviate oxidative damage and resist apoptosis to a certain extent.
[Key words] Sargassum fusiforme polysaccharide； Oxidative stress； Fatty liver； Palmitic acid非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的?l病机制及病理基础尚不完全明确，其中“二次打击”[1]被认为是目前最为成熟的解释发病机制的学说。氧化应激对于NAFLD的发生发展起着关键作用[2，3]。近几年，有报道称羊栖菜多糖（sargassum fusiforme polysaccharides，SFPS）经证实有抗凋亡[4]、抗氧化[5，6]、抗肿瘤[7，8]、抗肝纤维化[9，10]等多种生物活性。本研究主要观察羊栖菜多糖在软脂酸（palmitic acid，PA）所致肝细胞脂肪变模型中的干预作用，从而为中药防治NAFLD提供理论及实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验细胞
正常人肝细胞株L02。
1.2 实验材料
羊栖菜多糖（SFPS）由温州医科大学实验室制备。Dispase购自日本Sanko公司，MTT粉购自美国Sigma公司，软脂酸（PA）购自美国Sigma公司，DMEM高糖培养基购自美国Gibco公司，青霉素、链霉素购自上海碧云天生物技术研究所，优级胎牛血清购自杭州四季青公司，0.25%胰蛋白酶购自美国Gibco公司，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自美国Abcam公司，四甲基偶氮唑盐（MTT）购自北京索来宝生物公司，MDA和SOD检测试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品。 1.3 L02细胞脂肪变模型的建立和分组
在超净工作台、无菌条件下，采用贴壁法培养L02，将细胞分为五组，分别是对照组、PA模型组、SFPS-L组、SFPS-M组、SFPS-H组。对照组：加入细胞培养液。PA模型组：培养24 h后，给予0.5 mmol/L PA孵育48 h。SFPS-L组：25 μg/mL SFPS预处理24 h后，0.5 mmol/L PA孵育48 h。SFPS-M组：50 μg/mL SFPS预处理24 h后，0.5 mmol/L PA孵育48 h。SFPS-H组：100 μg/mL SFPS预处理24 h后，0.5 mmol/L PA孵育48 h。随后测定相应的指标。
1.4 MTT法检测细胞增殖活力
按上述分组，96孔板常规培养，每组6个复孔。终止培养前4 h每孔加入10 μL MTT，培养结束时弃上清液，每孔加入100 μL DMSO，微孔板震荡仪振荡10 min，应用酶标仪调至490 nm波长测各组OD值。以对照组A值为对照，计算PA模型组、SFPS-L组、SFPS-M组、SFPS-H组的细胞存活率。
1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡
收集各组细胞，细胞用PBS洗涤2次。重悬细胞，用10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI避光常温孵育5 min，流式细胞仪分析测得数据。
1.6 过氧化产物丙二醛含量（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）水平的测定
按以上分组处理后，收集培养板上的细胞和培养液，按照MDA和SOD检测试剂盒的标准操作流程，分别检测MDA含量、SOD水平。细胞分组培养6个复孔，取其均值。
1.7 统计学方法
采用SPSS16.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P
发表于 2018-8-16 22:57:05