[摘要]目的：设计、制备透皮型弹性蛋白样多肽（elastin-like polypeptide， ELP）融合蛋白，探索其作为皮肤美容制剂的潜能。方法：设计具有透皮特性的蛋白转导功能域（protein transduction domain， PTD）和ELP融合蛋白PTD-ELP，联合密码子优化、重叠延伸PCR和定向递归连接等技术构建其原核表达载体。在此基础上将该载体转化至大肠杆菌中，进行异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-Thiogalactoside， IPTG）诱导表达并对目标蛋白的亚细胞定位和可溶性进行分析。结果：成功构建了携带PTD-ELP读码框架的原核表达载体，携带该载体的大肠杆菌在IPTG诱导5h时PTD-ELP融合蛋白的表达量达到峰值，约占菌体总蛋白的23.6%；亚细胞定位分析表明PTD-ELP融合蛋白主要以包涵体形式在胞内表达。结论：成功设计并构建了能够表达PTD-ELP融合蛋白的原核表达载体并在大肠杆菌中实现了其高效表达，为深入探讨PTD介导的ELP透皮给药在逆转皮肤衰老和预防、治疗光老化中的应用奠定了基础。
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[关键词]弹性蛋白样多肽；蛋白转导功能域；原核表达；重组蛋白
[中图分类号]Q591.2 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2017）10-0064-04
Abstract： Objective To design and express an elastin-like polypeptide （ELP） fusion protein which can be transcutaneously delivered to skin tissues to explore its potential as a skin cosmetics agent in the future. Methods A protein transduction domain （PTD）-ELP fusion protein with transdermal properties was designed and back-translated with E.coli-preferred codons. And its expression vector was constructed by overlap extension PCR and recursive directional ligation. After transforming the vector into Escherichia coli cells， the PTD-ELP protein was expressed by IPTG induction and the subcellular location and the solubility of the recombinant protein were analyzed. Results A prokaryotic vector containing PTD-ELP-coding cassette was successfully constructed as designed. And the E.coli cells harboring the vector could express the fusion protein after IPTG induction， which reached the highest level at 5h post induction with amount of 23.6% of total bacterial proteins. Further analysis demonstrated that PTD-ELP protein was subcellularly located in cytoplasm as insoluble inclusion bodies. Conclusion The recombinant prokaryotic expression vector was constructed successfully and the PTD-ELP fusion protein was efficiently expressed in Escherichia coli cells. These results laid a foundation for further investigating whether PTD-mediated transdermal delivery of ELP could prevent skin aging and reverse photoaging.
Key words： elastin-like polypeptide； protein transduction domain； prokaryotic expression； fusion protein
??性蛋白是在维持皮肤组织结构和功能中发挥重要作用的细胞外基质蛋白，其约占皮肤总蛋白成分的2%[1-2]。弹性蛋白前体是由成纤维细胞和角质细胞合成并分泌的、分子量约为60～72kDa的可溶性弹性蛋白原，后者可在赖氨酰氧化酶的作用下发生分子内和分子间交联形成不溶性弹性蛋白，进而维持皮肤弹性[3]。弹性蛋白在人体内的合成从出生开始逐渐升高到青春期达到峰值，此后迅速下降。相关研究证实[4]，在光老化过程中，基质金属蛋白酶表达上调从而引发弹性蛋白降解，致使皮肤组织出现日光性弹力纤维变性。化妆品中添加动物组织源性的弹性蛋白水解产物用于延缓皮肤衰老、对抗光老化、促进皮肤细胞增殖和诱导皮肤年轻化等由来已久，然而动物源性蛋白存在人畜共患病风险，同时弹性蛋白因分子量较大而难以穿越表皮屏障进入浅表真皮组织发挥其生物学作用[5]。因此使用基因工程技术设计、制备具有透皮能力的重组弹性蛋白具有重要意义。 1 材料和方法
1.1 材料：原核表达载体pET28a购自Novagen公司；克隆载体pSP73购自Promega公司，ER2566购自NEB公司；限制性核酸内切酶Nco I、Xho I、BamH I和Bgl II、T4 DNA Ligase、Pyrobest DNA Polymerase购自Takara公司；IPTG、Tris和SDS购自Amresco公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺购自Sigma公司；GeneRuler DNA Ladder Mix和PageRuler Prestained Protein Ladder购自Fermentas公司；引物pPTD1： 5’-TTT CTC GAG TGC GGC CGC AAG CTT GTC GAC GGA GCT CGA ATT CGG ATC CAC GAC GAC GC-3’， pPTD2： 5’-GCC GTG GTT ATG GCC GTA AGA AAC GTC GTC AGC GTC GTC GTG GAT CCG AAT TCG AGC TC-3’， pPTD3： 5’-CAT CAT CAT CAT CAT CAC AGC GGC ATT GAA GGC CGT GGT TAT GGC CGT AAG AAA CGT CG-3’， pPTD4： 5’-AAA CCA TGG GCA GCA GCC ATC ATC ATC ATC ATC ACA GCG GCA TTG AAG G-3’， pELP1：5’-AAA AGA TCT GTG GCG CCG GGC GGT GTT GCG CCG GGC GTG GGT CTC GCG CCG-3’和pELP2：5‘-AAA CTC GAG CTA TTA GGA TCC TAC GCC CGG CGC GAG ACC CAC GCC CGG CGC-3’由上海鼎安生物科技有限公司合成。
1.2 构建原核表达载体pPTD：配置反应体系（10×Pyrobest BufferⅡ5.0μl，dNTP4.0μl，Pyrobest DNA Polymerase0.25μl，浓度为10μM的引物pPTD1和pPTD4各1.0μl，浓度为1μM的引物pPTD2和pPTD3各1.0μl，加去离子水至终体积为50μl），进行重叠延伸PCR。循环参数为变性30s，退火30s，延伸30s，共30个循环。反应结束后使用DNA回收试剂盒回收PCR产物，经NcoI和XhoI双酶切后克隆至pET28a的相应酶切位点之间获得pPTD，经DNA测序证实。
1.3 ELP编码序列的设计和构建：根据人弹性蛋白特有基序VAPGXG设计ELP氨基酸序列为VAPGVGVAPGVGVAPGVGS，使用大肠杆菌偏爱密码子反翻译为cDNA序列，并在此基础上设计引物pELP1和pELP2，进行重叠延伸PCR后以Bgl II和Xho I双酶切后克隆至pSP73的相应酶切位点获得pSP73-3ELP，经DNA测序证实后使用定向递归连接技术构建pSP73-96ELP。
1.4 PTD-96ELP原核表达载体的构建：利用Bgl II和BamH I能够酶切产生相同的粘端，使用Bgl II和Xho I将96ELP从pSP73-96ELP上切下并克隆至pPTD的BamH I和Xho I之间获得原核表达载体pPTD-96ELP，经Bgl II和Xho I双酶切鉴定后保存备用。
1.5 PTD-96ELP在大肠杆菌ER2566中的诱导表达：使用pPTD-96ELP转化ER2566感受态细胞并涂布在含30μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板。经37℃过夜培养筛选后，挑取生长状态良好的菌落接种于含30μg/ml卡那霉素的LB中，置于37℃、220rpm条件下振荡培养12h获得种子液。将种子液用含30μg/ml卡那霉素的LB以1：100比例稀释，置于37℃、220rpm条件下振荡培养2h，加入1M IPTG至终浓度为1mM进行诱导表达，分别在诱导3h、4h、5h、6h、7h和8h时收获样品进行SDS-PAGE分析。
1.6 PTD-96ELP表达产物的可溶性分析：将200ml诱导后菌液在4℃、2 000g条件下离心15min，收获菌体并重悬于20ml去离子水中。在-20℃～37℃反复冻融3次后超声破碎菌体，超声条件为400W，工作5s，间隔5s，重复200次。在4℃、16 000g条件下离心30min，分别取上清和沉淀制样进行SDS-PAGE分析。
1.7 PTD-96ELP表达产物的亚细胞定位分析：将200ml诱导后菌液在4℃、2 000g条件下离心15min，收获菌体并重悬于高渗液（pH8.0，30mM Tris-HCl，1mM EDTA，20%蔗糖）中，室温搅拌10min。在4℃、2 000g条件下离心15min，收获菌体重悬于预冷的5mM MgSO4中，冰浴??拌10min后4℃、10 000g条件下离心15min，分别取上清和沉淀制样进行SDS-PAGE分析。
2 结果
2.1 PTD-96ELP的设计：如图1所示，PTD-ELP融合蛋白由4个功能域构成，从氨基端到羧基端分别为：①组氨酸标签，用于检测和纯化融合蛋白；②X因子a识别位点，用于最终切除组氨酸标签；③来源于HIV反式转录激活因子（transactivator of transcription， TAT）的PTD，用于介导ELP穿越表皮屏障；④32倍串联重复的VAPGVGVAPGVGVAPGVGS，用于发挥弹性蛋白样生物学作用。
2.2 pPTD-96ELP的鉴定和测序分析结果：对原核表达载体pPTD-96ELP进行Bgl II和Xho I双酶切鉴定可见约2000bp新生条带（图2），与预期相符；pPTD-96ELP中的目标蛋白开放读码框架如图3所示，进一步DNA测序证实插入序列与设计完全相符（图4）。 2.3 PTD-96ELP在ER2566中的?T导表达检测结果：如图5所示，SDS-PAGE分析表明，携带pPTD-96ELP的ER2566工程菌经IPTG诱导后可表达分子量约为53kDa的新生蛋白，与预期相符；同时，目标蛋白的表达量在IPTG诱导5h时达到峰值，约占菌体总蛋白的23.6%，进一步延长诱导表达时间并不能提高蛋白表达量。
2.4 PTD-96ELP表达产物可溶性分析结果：如图6所示，SDS-PAGE分析表明，携带pPTD-96ELP的ER2566工程菌经IPTG诱导表达5h后目标蛋白主要位于细胞内，而周质空间内几乎没有目标蛋白。同时，目标蛋白主要位于菌体超声裂解后的沉淀中，提示该蛋白主要以包涵体形式表达。
3 讨论
鉴于具有串联重复序列的蛋白常因特定tRNA丰度的限制而难于表达，本研究使用大肠杆菌偏爱密码子对VAPGVGVAPGVGVAPGVGS基本单元的编码序列进行了修饰，并在此基础上使用定向递归克隆技术制备了ELP串联重复序列cDNA并将之与PTD编码序列融合，构建了能够表达重组PTD-ELP融合蛋白的原核表达载体并在大肠杆菌中实现了PTD-ELP高效表达。
弹性蛋白的一级结构中富含有VPGXG和VAPGXG基序，其中X为除脯氨酸外的任意氨基酸。目前由人弹性蛋白第24个外显子编码的VGVAPG寡肽已经广泛用做美容护肤品添加剂[6-8]，其能够通过与分子量为67kDa的高亲和性弹性蛋白受体结合发挥其生物学活性[9]。大量研究证实VGVAPG寡肽不但能够趋化成纤维细胞，还能刺激人皮肤成纤维细胞增殖[10]，而VPGVG及其多聚体则无此作用[11]。同时，VGVAPG寡肽能促进角质形成细胞迁移和分化[12]。此外，VGVAPG寡肽能促进人血管内皮细胞迁移和成管，表明其能促进血管生成[13]。最近研究发现VGVAPG寡肽能通过激活IGF-1受体上调弹性蛋白表达并促进弹性组织生成[14]，并且含有（VGVAPG）3基序的多肽能上调弹性蛋白和胶原蛋白在人皮肤成纤维细胞和人皮肤组织体外培养物中的表达[15]。这些资料表明含有VGVAPG基序的多肽具有对抗皮肤衰老和促进皮肤组织再生的功能。本研究采用的VAPGVGVAPGVGVAPGVGS基本单元中含有两个VGVAPG基序，因此在理论上融合蛋白PTD-ELP也能够通过刺激成纤维细胞增殖、诱导角质形成细胞迁移和分化、促进血管生成以及上调弹性蛋白和胶原蛋白表达等多种机制改善皮肤质量、延缓皮肤衰老，并极具潜力成为一种安全、高效的美容生物制剂。
表皮屏障虽然能保护皮肤组织免受外界物理化学损伤，但是也限制了功能分子的经皮给药效率。近年来研究发现，HIV TAT-PTD、PEP-1和IMT-P8多种不同来源的PTD均能够赋予与之融合表达的蛋白分子穿越表皮屏障的能力[16-18]。为了能够获得高效原核表达，本研究中选用了报道数量较多、透皮能力确切、长度仅为11个氨基酸残基的TAT-PTD[16，19-21]。为了实现重组PTD-ELP在大肠杆菌中的高效表达，使用大肠杆菌偏爱密码子对PTD和ELP编码序列进行了改造。虽然结果显示密码子优化后PTD-ELP的表达量较高，但是目标蛋白主要存在于包涵体中，必须在溶解包涵体后才能应用ELP的温度依赖性相变作用进行规模纯化。因此优化诱导表达工艺以实现PTD-ELP的可溶性表达将是下一步工作的研究重点。
综上所述，本研究设计了具有透皮能力的PTD-ELP蛋白，联合密码子优化和定向递归连接技术构建了其原核表达载体，并实现了PTD-ELP在大肠杆菌中的高效表达，不仅建立了相对简单的ELP串联重复序列构建方法，而且为深入探讨ELP透皮给药在对抗皮肤衰老和促进皮肤年轻化中的作用奠定了基础。
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[收稿日期]2017-08-21 [修回日期]2017-09-06
?辑/朱婉蓉
发表于 2018-8-16 22:40:13