摘要：目的探讨姜黄素联合PDTC体外抗K562细胞的作用。方法MTT法检测姜黄素单独或联用PDTC后对K562细胞增殖活性的影响；Hoechst33342染色法观察细胞凋亡形态；Western blot法检测Cleaved Caspase 3的表达活性。结果10 μmol?L-1姜?S素联合25 μmol?L-1的PDTC后，可显著提高对K562细胞增殖的抑制活性，并显示出诱导细胞凋亡的形态学特征，使细胞Cleaved Caspase 3表达增加。结论姜黄素联合PDTC可增强抗K562细胞作用，机制与诱导K562细胞凋亡作用有关。
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关键词：姜黄素；吡咯烷二硫代氨基甲酸盐；细胞凋亡；Caspase 3
中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1007-2349（2018）01-0072-03
【Abstract】Objective： To study the effect of curcumin combined with PDTC on anti- leukemia K562 cells in vitro. Methods： MTT assay was used to detect the effect of curcumin alone or in combination with PDTC on the proliferation of K562 cells. The morphology of apoptotic cells was observed by Hoechst33342 staining. The expression activity of Cleaved Caspase 3 was detected by Western blot. Results： After treated with 10 μmol?L-1 curcumin and 25 μmol?L-1 PDTC， the inhibitory activity on proliferation of K562 cells significantly increased， and the morphological characteristics of abduction apoptosis were also proved. The expression of Cleaved Caspase 3 increased. Conclusion： Curcumin combined with PDTC can enhance the anti-K562 cells and its mechanism is related to the abduction apoptosis of K562 cells.
【Key words】curcumin，pyrrolidine dithiocarbamate，apoptosis， Caspase 3
核因子-kappaB（nuclear factor-kappaB，NF-κB）与肿瘤细胞的增殖、凋亡有密切关系[1]。研究表明，吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）特异性抑制NF-κB后，对人白血病K562细胞的增殖有抑制作用、并可诱导凋亡，还可逆转肿瘤耐药[2]。姜黄素及其类似物抗K562细胞作用明确、且呈多靶点性，但存在不稳定、易降解、体内吸收差、低浓度下抑制活性较弱的缺点[3，4]。采用高效低毒的中药活性成分与肿瘤化疗药联合应用以减少化疗药的用量、提高化疗效果、降低药物不良反应，是抗肿瘤药物研究的重要方向。本文旨在采用低浓度的姜黄素联合PDTC作用于白血病K562细胞，初步探讨姜黄素联合PDTC对抗K562细胞作用的影响，为治疗慢性粒细胞白血病的药物研究提供参考。
1材料与方法
1.1材料人白血病K562细胞（中国科学院上海细胞库）；姜黄素（sigma公司）；优等胎牛血清、RPMI1640培养基（Hyclone，Thermo公司）；MTT试剂盒（南京凯基生物公司）；Hoechst33342（sigma公司）；Cleaved Caspase 3（沈阳万类生物科技有限公司）；PDTC、RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂PMSF、ECL增强型化学发光试剂、BCA蛋白浓度测定试剂盒、Actin、HRP（碧云天生物技术有限公司）。主要仪器有Multiscan MK 3-酶标仪（Thermo公司）、IX51-倒置荧光显微镜（Olympus公司）、ImageQuant LAS 4000凝胶成像系统（GE公司）。
1.2细胞培养将K562细胞培养于RPMI1640培养液（含10% 胎牛血清）中，于37℃、5% CO2恒温培养箱内培养，长至对数生长期用于各实验。
1.3MTT法检测细胞增殖取对数生长期细胞接种于96孔板，调整细胞浓度为5×103个/mL。隔夜后，加入终浓度为0、1、5、10、30、50 μmol?L-1的姜黄素，及10 μmol?L-1的姜黄素与15、25 μmol?L-1PDTC单用或联用，空白组加入等体积不含药物及细胞的培养基，每组均设置三个复孔。培养48 h后，每孔加入5 mg?mL-1的 MTT溶液10 μL，继续培养3 h，加入100 μL SDS三联液（10%SDS-5%异丁醇-0.012 mol?L-1 HCL），同时各组设置加药但未加MTT对照孔，12h后，570 nm波长处检测吸光度（A）值。按公式计算细胞抑制率：细胞抑制率=[（空白组A值-药物组A值）/空白组A值]×100%[5]。
1.4Hoechst33342染色法观察细胞凋亡形态取对数生长期细胞，采用不同浓度药物处理后，加入Hoechst 33342（5 μg?mL-1）染色液30 μL，于37℃避光孵育20 min，PBS洗涤2次，调整细胞数后，取适量转入96孔板，于倒置荧光显微镜下观察细胞形态。 1.5Western blot方法检测Cleaved Caspase 3的表达活性取对数生长期细胞，加药后培养48 h，收集细胞，以PBS洗涤细胞2次，加入RIPA裂解液（含1 mmol?L-1的PMSF）冰上
裂解10 min。13000 r?min-1离心10 min，吸取上清，得到细胞总蛋白。用BCA法进行蛋白定量，取30 μg蛋白与上样缓冲液混合，95℃变性5 min。12% SDS-PAGE凝胶中电泳，转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗后4℃孵育过夜，TBST洗涤3次，每次10 min，加入二抗室温孵育50 min，TBST洗涤3次，每次10 min，加入ECL增强型化学发光试剂，置于凝胶成像系统成中成像[6]。
1.6统计学分析采用SPSS17.0软件进行统计分析，所有数据以形式表示，组间比较采用单因素方差分析，P参考文献：
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（收稿日期：2017-10-27）
发表于 2018-8-15 23:03:22