2018芒柄花黄素对人肺癌细胞A549增殖与凋亡的影响及其机制

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　　摘要：探讨芒柄花黄素对人肺癌细胞A549增殖和凋亡的影响及作用机制。方法：20，40，80μmol/L的芒柄花黄素作用于人肺癌细胞A549后，采用MTT法分析芒柄花黄素对A549细胞增殖的影响；流式细胞术检测芒柄花黄素对A549细胞凋亡的影响，采用RT-PCR检测芒柄花黄素对A549细胞Bcl-2mRNA的表达。结果：经芒柄花黄素作用后，MTT结果显示A549细胞的生长抑制率明显增加，流式细胞术检测显示A549细胞凋亡率升高，此外，RT-PCR检测A549细胞Bcl-2mRNA表达水平明显降低。结论：芒柄花黄素诱导肺癌细胞A549凋亡，抑制其生长，这可能与其下调Bcl-2mRNA表达有关。
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　　关键词：芒柄花黄素；肺癌；凋亡；Bcl-2mRNA
　　中图分类号：R734.2
　　文献标志码：A
　　文章编号：1008-2409（2015）01-0028-04
　　肺癌发生于支气管黏膜上皮，亦称支气管癌，是较为常见的恶性肿瘤。据报道，肺癌的发病率自1988～2005年18年间，以每年1.63%的速度增加，其中男性每年增长1.30%，女性为2.34%，且不同地区不同性别肺癌的年龄与死亡发病比相似，大多在0.7和1之间，说明肺癌的预后较差，每年的病死病例接近新发病例。传统的治疗手段如手术本身有一定的适应证和局限性；而放射治疗（放疗）以及用细胞毒类抗肿瘤药物的化学治疗（化疗），由于其毒副作用较大，应用范围也受到明显限制。一些来源于天然植物的中草药，具有抗肿瘤的作用，且无毒性或毒性作用小，已成为近年来肺癌治疗研究的热点。植物来源的芒柄花黄素，分离自红三叶草，1种生物活性异黄酮，具有抗肿瘤作用。本研究拟通过观察不同浓度芒柄花黄素对肺癌细胞增殖和凋亡的影响及探讨其可能的作用机制，为肺癌的治疗提供新思路。
　　1材料与方法
　　1.1主要材料
　　A549细胞株（上海细胞生物研究所），RP-MI1640培养基、胎牛血清（美国Gibco公司），芒柄花黄素（纯度>98.0%，美国Sigma公司）、MTT（美国Sigma公司），流式细胞仪（美国BD公司），V-FITC凋亡检测试剂盒（上海碧云天研究所）。
　　1.2细胞培养
　　A549细胞用含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的1640培养液，将细胞置于5%CO2的37℃培养箱中进行培养传代。取对数生长期细胞用于实验。
　　1.3药物配制
　　芒柄花黄素用DMSO配制成浓度100mmol/L的药液，置4℃冰箱避光保存，用时以含10%胎牛血清的1640培养基按比例稀释成所需要的浓度。
　　1.4MTT检测A549细胞增殖
　　收集对数期细胞，按5×103个细胞/孔的密度接种于96孔板中，每孔加入细胞悬液100μl。待细胞贴壁后分别加入芒柄花黄素使得终浓度为20，40，80μmol/L，另设对照组（加入等体积的完全培养基），每组设5个复孔。药物分别作用24，48，72h后，弃上清，以MTT法酶标仪测吸光值（A490），实验独立重复3次。
　　1.5流式细胞术检测A549细胞凋亡率
　　收集消化后A549细胞，调整细胞悬液浓度，按每孔1×106个细胞接种到6孔板中。待细胞贴壁后，加入含设计浓度芒柄花黄素的完全培养基，另设对照组，每组设5个复孔。培养48h后，收集各个组的细胞，预冷的PBS溶液洗涤3次后，用Annexin V-FITC及碘化丙啶（PI）（50μg/ml）室温避光染色15min，流式细胞仪检测凋亡率。
　　1.6RT-PCR检测Bcl-2mRNA表达
　　设计浓度芒柄花黄素处理A549细胞48h后，提取细胞总RNA，经紫外分光光度计测总RNA纯度和含量，将总RNA逆转录为cDNA，参照试剂盒说明书进行。再以eDNA为模板用Real-time PCR检测Bcl-2的mRNA表达水平，结果以Bcl-2/β-actin密度比值表示。β-actin引物：上游，5-GGCATCCT-CACCCTGAAGT-3；下游，5-GGGATAGCACAGC-CTGGAT-3。Bcl-2引物：上游，5-CATGTGTGTG-GAGAGCGTCAA-3；下游，5-GCCGGTTCAGG-TACTCAGTCA-3。Real-time PCR反应条件：50℃2min，95℃10min，95℃15s，60℃60s，共进行40个循环。
　　1.7统计学处理
　　数据用SPSS 18.0统计软件分析，P