2018MPTP诱导影响亚急性与慢性帕金森病模型小鼠黑质多巴胺能神经元

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　　摘要：目的：探索1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）诱导的亚急性与慢性帕金森病（PD）模型小鼠的黑质多巴胺能神经元改变。方法：采用MPTP诱导亚急性与慢性PD小鼠模型，分析小鼠酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元数目和小鼠行为学悬挂评分。结果：慢性与亚急性PD模型小鼠TH阳性神经元计数分别降至正常水平的21.02%与17.94%；且TH阳性神经元计数下降均早于行为学改变。结论：小鼠慢性模型比亚急性模型更接近帕金森病的病理与病程。
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　　关键词：1-甲基-4-苯基-1，2，3，6四氢吡啶；帕金森病；多巴胺能神经元
　　中图分类号：R742
　　文献标志码：A
　　文章编号：1008-2409（2015）01-0024-04
　　1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）具有特异性黑质多巴胺神经元的神经毒性作用，能导致人类及多种模型动物出现帕金森病（PD）样症状。MPTP诱导PD样动物模型已成为研究PD发病机制、神经生化、神经病理、行为学、精神障碍及药物作用等理想的模型。根据不同的给药时间及剂量，MPTP诱导的PD小鼠模型可分为急性、亚急性及慢性模型，由于急性MPTP模型在病理上所观察到的改变仅有多巴胺能神经元的急性损害，难以反映临床PD进行性病理损害的各种特征，其应用有限。使用较为广泛的有亚急性及慢性模型，但关于二者间哪一种能更好地模拟PD的慢性病理过程并无相关报道。笔者拟通过比较亚急性及慢性MPTP诱导小鼠PD模型的酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元数目与其悬挂行为的评分关系，以期为PD动物模型的病理研究提供更多理论依据。
　　1材料与方法
　　1.1材料与试剂
　　Anti-TH抗体、anti-TH及phospho（Ser40）抗体购自美国CST公司，MPTP购自美国Sigma公司；其他试剂均为国产或进口分析纯。C57BL/6小鼠，雄性，体重22～25g，8.0～8.5周龄，由徐州医学院实验动物中心提供。
　　1.2动物分组
　　慢性MPTP模型分组：C57BL/6小鼠60只，随机分为实验组和对照组，每组30只。每组再按时间点分1周、2周、3周、4周、5周5个亚组，每亚组6只。亚急性MPTP模型：C57BL/6小鼠60只，随机分为实验组和对照组，每组30只。按5个不同的时间点再分1d、2d、3d、4d、5d 5个亚组，每亚组6只。每亚组相应时间点给药后1d先行行为学测试；行为学检测后，戊巴比妥钠麻醉下，开胸经主动脉依次灌注生理盐水、4%多聚甲醛，灌毕取鼠脑后固定备生物学检测用。
　　1.3给药方法
　　慢性MPTP模型：实验组小鼠，腹腔注射MPTP 25mg/kg，每周2次，间隔时间相同，连续给药5周，共10次，对照组于同时间腹腔注射同体积的生理盐水。亚急性MPTP模型：实验组小鼠，腹腔注射MPTP 30mg/kg，1次/d，连续给药5d，对照组于同时间腹腔注射同体积的生理盐水。
　　1.4行为学测试
　　参照文献Ⅲ的测试方法，自制有机玻璃悬挂实验箱，水平放置的金属杆直径1.5mm，距地面30cm，金属杆上方1cm加盖，避免小鼠翻坐于金属杆上，实验中动物悬挂于金属杆上，记录落地前的时间，并按下述标准进行悬挂评分：0～4s评0分，5～9s评1分，10～14s评2分，15～19s评3分，20～24s评4分，25～29s评5分，超过30s评6分。每次检测间隔1min，共检测5次取平均值。
　　1.5免疫组织化学染色
　　行为学检测后，使用戊巴比妥钠50mg/kg腹腔麻醉，开胸经主动脉先以生理盐水15ml冲洗血液，再用4%多聚甲醛40ml灌注固定。灌毕立即取鼠脑后固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋。黑质区段连续冠状切片，片厚6μm，切片分组收集，行TH免疫组织化学染色。计算机辅助图像分析系统进行图像分析，在200×高倍镜下分别对各时间点TH阳性细胞进行统计分析。将小鼠每个中脑组织切片从嘴侧至尾侧分为前、中、后3个区域。任意选择带有明显核仁、清晰轮廓的TH阳性神经元作为测量对象，测定单位面积内阳性细胞数。
　　1.6数据处理与分析
　　采用SPSS 13.0统计软件分析。计量资料均用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，多个实验组与对照组比较采用最小显著差法（LSD）。P统计学意义时，两组实验小鼠的悬挂评分均下降，对照组无明显改变；当悬挂评分下降有统计学意义时，慢性及亚急性组小鼠TH阳性神经元计数分别下降至正常的37.37%及38.16%；至造模完成时，TH阳性神经元计数分别下降至正常的21.02%及17.94%。见表1～4。
　　3讨论
　　MPTP在人和非人灵长类动物引起的PD综合征被认为最接近于人类原发性PD。MPTP高选择性地对多巴胺（DA）能神经元造成损伤。在胶质细胞中，MPTP经单胺氧化酶B（MAO-B）催化生成1-甲基-4-苯基-2，3-二氢吡啶离子后，经自发氧化生成活性毒素分子1-甲基-4-苯基吡啶离子。由于MPP+高度亲和多巴胺转运体，因此，被转运进入多巴胺能神经元。随后，MPP+进入如下3条可能的路径：①MPP+进入线粒体并沉积，进而阻止线粒体膜蛋白复合物的电子传递，破坏ATP的合成，并导致活性氧的不正常生成。②MPP+与胞质中其他酶发生反应，破坏细胞的正常代谢。③MPP+由囊泡单胺类载体运送进入突触囊泡中。依据MPTP的毒性机制，使用不同的给药方法和给药剂量可以对黑质致密部DA能神经元造成不同程度的损伤。
　　酪氨酸羟化酶是儿茶酚胺类活性物质生物合成的限速酶，在DA生物合成的调节中发挥重要作用。该酶在黑质纹状体系统中表达和活性的变化会直接影响到多巴胺的生物合成。PD动物模型及PD患者的TH从基因表达到酶蛋白含量及酶活性都有异常改变。TH阳性神经元数目可反映纹状体DA含量及DA能神经元的数量。
　　MPTP造成脑损伤后，黑质致密部DA能神经元数目减少，MPTP注射间隔和剂量不同，损伤类型也不同。本实验中，两种给药方法均可造成小鼠TH+神经元计数下降，小鼠TH+神经元计数下降均早于行为学改变。至造模完成时，慢性及亚急性小鼠PD模型TH+神经元计数已下降至正常的21.02%及17.94%，均符合人类帕金森病的病理特征。但亚急性MPTP小鼠模型在短期内对DA能神经元造成严重损毁，神经元死亡以凋亡为主，和亚急性模型相比，慢性模型可使纹状体多巴胺含量缓慢下降并维持在较低水平，且建模过程中神经损伤与修复同时存在，能更好地模拟帕金森病慢性进行性的病程特点。
　　[责任编辑：向秋]