[摘要] 目的 探?半乳糖凝集素-9（Galectin-9）蛋白过表达对卵巢癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响。 方法 将卵巢癌细胞SKOV-3分为转染pcDNA3.1-Galectin-9组、pcDNA3.1组和空白对照组，通过Western blot检测Galectin-9蛋白的表达，CCK-8检测Galectin-9蛋白对SKOV-3增殖能力的影响，划痕试验验证Galectin-9对SKOV-3迁移能力的作用，Annexin-V-FITC/PI双染法检测Galectin-9蛋白对SKOV-3凋亡的影响。 结果 Western blot结果显示，转染pcDNA3.1-Galectin-9组Galectin-9蛋白表达明显高于空白对照组和pcDNA3.1组，差异均有高度统计学意义（均P http://
[关键词] 半乳糖凝集素-9；卵巢癌；细胞增殖；细胞迁移；细胞凋亡
[中图分类号] R737.31 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）01（c）-0013-04
[Abstract] Objective To investigate the effects of overexpression of galectin-9 on the proliferation， migration and apoptosis of ovarian cancer cells. Methods The ovarian cancer cells SKOV-3 were divided into pcDNA3.1-galectin-9 transfection group， pcDNA3.1 group and blank control group， Western blot was used to detect the expression of galectin-9 protein， CCK-8 was used to detect the effects of galectin-9 protein for multiplication capacity of SKOV-3， scratch test was used to verify the effects of galectin-9 protein for transfer ability of SKOV-3， Annexin-V-FITC/PI double staining method was used to detect the effects of galectin-9 protein for apoptosis of SKOV-3. Results The results of Western blot showed that the expression of galectin-9 protein in pcDNA3.1-galectin-9 transfection group was significantly higher than those in blank control group and pcDNA3.1 group， the differences were all highly statistically significant （all P [Key words] Galectin-9； Ovarian cancer； Cell proliferation； Cell migration； Cell apoptosis
卵巢癌为妇科常见的恶性肿瘤之一，具有侵袭性强、恶性程度高、转移快、病死率高和复发率高等特点[1]，半乳糖凝集素-9（Galectin-9）是半乳糖凝集素家族成员之一，具有嗜酸性粒细胞趋化作用及抗肿瘤功能，在多种恶性肿瘤组织中呈低表达。文献报道，通过免疫组织化学发现，Galectin-9存在于宫颈上皮内瘤变组织和宫颈癌中，且宫颈癌中的表达水平明显低于宫颈上皮内瘤变组织[2-3]；同时Galectin-9的低表达促进了食管癌细胞ESCC的侵袭和迁移，参与了食管癌的发生、发展过程；在卵巢癌组织中Galectin-9阳性表达率低于癌旁组织和良性卵巢组织，且与卵巢癌的发生及淋巴结转移密切相关[4]；但Galectin-9对卵巢癌细胞的作用还未明确，因此本研究通过体外研究探讨Galectin-9对卵巢癌细胞系（SKOV-3）增殖、迁移和凋亡的影响，阐明其在卵巢癌发生、发展中可能的作用机制，为卵巢癌的靶向治疗提供新的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
人卵巢癌SKOV-3细胞株由青岛大学医学院附属青岛市立医院肝胆胰细胞实验室提供；RPMI 1640培养液（批号：AB10113944）购自美国HyClone公司；胎牛血清（批号：11F289）购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；青链双抗（批号：20161019）购自美国Hyclone公司；CCK-8（批号：20170206）和膜联蛋白-V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin-V-FITC/PI）（批号：A005-3）购自上海七海生物科技有限公司；Galectin-9蛋白购自美国Cayman Chemical公司；Galectin-9过表达质粒和空载质粒由上海生物工程技术服务公司构建和提供，脂质体Lipofectamine 2000（批号：11668019）购自美国Invitrogen公司；SDS-凝胶配制试剂盒（批号：P0012A）、RIPA裂解液（批号：P0013C）、蛋白酶抑制剂（批号：P1005）和PVDF膜（批号：FFP24）购自上海碧云天生物技术有限公司；单克隆抗体羊抗人Galectin-9抗体购自英国R&D Systems，Abingdon公司；单克隆抗体鼠抗人肌动蛋白（β-actin）（批号：ab8226）购自美国abcam公司；单克隆山羊抗兔抗体（辣根过氧化物梅标记）（批号：BL003A）、单克隆山羊抗鼠抗体（辣根过氧化物梅标记）（批号：BL003B）均购自美国CST公司。
1.2 SKOV-3细胞的培养
SKOV-3细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，于培养箱（37℃、5%的CO2）中进行培养。根据细胞生长状况，每2天左右进行1次换液，当细胞覆盖瓶底80%左右时，以0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，以1∶2传代培养。实验选用生长状态良好的第2～4代细胞。
1.3 细胞转染及筛选
将SKOV-3细胞以3×105/孔的密度接种于6孔板中，每组设6个复孔，当细胞覆盖瓶底80%左右时，按照LipofectamineTM 2000脂质体说明书转染pcDNA3.1-Galectin-9组及pcDNA3.1组，每孔脂质体5 μL、质粒2.5 μg。通过梯度试验确定顺铂对SKOV-3细胞的最佳筛选药物浓度为15 mg/mL，转染24 h后，将6孔板中的细胞消化，并以1∶10的比例接种于24孔板中，于转染24 h后加入顺铂。隔1 d换1次筛选培养基，筛选1周，转移至25 cm2培养瓶中扩增培养。同时设置未进行转染操作的空白对照（空白对照组）。
1.4 Western blot检测Galectin-9蛋白的表达
实验分组同“1.3”。取三组对数生长期细胞各1瓶，用含有蛋白酶抑制剂的裂解液提取总蛋白，BCA法测蛋白浓度。取等量蛋白样品（40 μg）进行电泳，并转移至PVDF膜上。用含有5%脱脂奶粉室温封闭2 h，弃去封闭液，分别加入用5%BSA的TBST稀释的一抗（Galectin-9 1∶5000；β-actin 1∶2000），4℃过夜。一抗孵育结束后，TBST洗涤，然后分别用HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶2000）和HRP标记的山羊抗鼠IgG（1∶2000）室温孵育2 h，TBST充分洗涤后，电化学发光显影。实验重复3次。
1.5 CCK-8检测Galectin-9对细胞增殖的影响
分别取三组对数生长期细胞，胰酶消化后接种于96孔培养板（5×103个细胞/孔）中，每孔加入200 μL培养基，每组设12个复孔，继续培养24 h，使细胞贴壁。按照CCK-8试剂盒提供的步骤分别检测0、12、24、36 h和48 h的细胞增殖能力。
1.6 划痕试验检测Galectin-9对细胞迁移的影响
??验分组同“1.3”。同样分别取三组对数生长期细胞，每组设3个复孔，分别转移到培养皿中，在低血清培养基中培养细胞贴壁且达到80%融合时，换无血清培养基培养，在培养皿中划一条线性刮痕，用PBS洗涤细胞3次后将细胞继续孵育（37℃，5%CO2），并在诱导刮伤后0、12、24 h后使用显微镜获得图像。划痕愈合率=（划痕后的即刻面积-划痕后12 h或24 h的愈合面积）/划痕后的即刻面积×100%。划痕愈合率越高，表明细胞的迁移能力越强。采用Image-Pro Plus 6.0软件处理。
1.7 Annexin-V-FITC/PI双染法检测Galectin-9蛋白对细胞凋亡的影响
实验分组同“1.3”。取三组生长状态良好的接近融合的细胞，等量接种于6孔板中（2×104/孔），每组设3个复孔，当6孔板细胞长到80%左右时，按照Annexin-V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒说明书进行操作。每组样品分别加入400 μL结合缓冲液，5 μL Annexin V，混匀，室温避光孵育15 min，然后加入10 μL PI，混匀，冰浴避光孵育5 min，在30 min内进行流式细胞仪检测。用CELL Quest软件对结果散点图进行分析，获得由4个象限组成的细胞直方图，每个象限的细胞数目就是检测细胞总数所在点的组分。 1.8 统计学方法
应用SPSS 22.0软件进行相关统计学分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验。以P 0.05）。见图1。
2.2 Galectin-9能抑制?胞的增殖
CCK-8结果显示，转染pcDNA3.1-Galectin-9组细胞增殖能力（0.772±0.124）明显低于空白对照组（1.135±0.347）和pcDNA3.1组（1.063±0.248），差异均有高度统计学意义（t = 4.266，P 0.05）。通过时间曲线（0、12、24、36 h和48 h）发现，Galectin-9对抑制SKOV-3细胞的增殖能力呈现时间依赖性。见图2。
2.3 Galectin-9能抑制细胞的迁移能力
转染pcDNA3.1-Galectin-9组的愈合率[（26.03±2.11）%]明显高于pcDNA3.1组[（14.53±1.14）%]和空白对照组[（14.42±0.36）%]，差异均有高度统计学意义（t = 17.78，P 0.05）。
2.4 Galectin-9能促进细胞凋亡
转染pcDNA3.1-Galectin-9组的凋亡率[（57.21±0.89）%]明显高于pcDNA3.1组[（14.85±1.57）%]和空白对照组[（15.02±0.93）%]，差异均有高度统计学意义（t = 79.51，P 0.05）。
3 讨论
目前卵巢癌尚缺乏特异性的临床症状，诊断困难，确诊时大部分已处于肿瘤后期阶段[5-6]，晚期患者5年生存率不到30%[1]。Galectin-9最早由Wada等[7]从动物胚肾组织中分离得到，是由130个高度保守的氨基酸序列组成糖识别结合域[8]，在结节型硬化型霍奇金肿瘤组织中克隆并首次命名[9]。有报道发现，Galectin-9抑制胶质瘤细胞的增殖及迁移，为胶质瘤提供了新的治疗方向[10]；Galectin-9的表达降低与多种恶性肿瘤的进展和淋巴转移具有明显相关性，研究发现，在乳腺癌和恶性黑色素瘤患者中，Galectin-9表达的缺失与肿瘤转移呈负相关[11-14]；Galectin-9表达的缺失与肿瘤转移呈负相关[15]，且Galectin-9表达水平较高患者的中位生存时间明显高于Galectin-9低表达的患者；Galectin-9的表达与宫颈鳞状细胞癌病理分级呈正相关[16]，这可能与组织特异性有关；Galectin-9的表达降低导致结肠癌的发生率升高[17]；在良性卵巢组织中，Galectin-9呈散在或弥漫性表达，而在卵巢癌组织中呈低表达，且与临床分期、病理分期及淋巴结转移密切相关[4，18]，但迄今为止，关于Galectin-9在卵巢癌细胞系SKOV-3中作用的研究甚少。
研究表明，Galectin-9作为细胞质蛋白，可以靶向分泌到细胞核或细胞质中，与细胞质和细胞核中的蛋白相互作用；在过敏反应中诱导嗜酸粒细胞聚集和活化，调节免疫；此外，Galectin-9可以通过p38和ERK信号通路调节细胞成熟和分化[12]，在介导细胞凋亡、黏附、细胞间聚集和肿瘤转移方面发挥重要作用。本研究构建了pcDNA3.1-Galectin-9转染细胞组、pcDNA3.1组和空白对照组，Western blot结果显示，转染组中Galectin-9蛋白表达上调，进而通过CCK-8和划痕试验证实，卵巢癌细胞SKOV-3转染pcDNA3.1-Galectin-9后，显著抑制SKOV-3细胞的活力、增殖和迁移能力；通过Annexin-V-FITC/PI双染法检测发现，转pcDNA3.1-Galectin-9的SKOV-3细胞凋亡率明显增高，提示Galectin-9可以促进卵巢癌细胞的凋亡，与Galectin-9在食管癌细胞中的研究结果一致[2]。
综上所述，Galectin-9的过表达能够抑制卵巢癌细胞SKOV-3的增殖和迁移，并能促进其凋亡，为卵巢癌的治疗及靶向药物研发提供理论依据。但Galectin-9如何调控卵巢癌的发生发展及侵袭转移的分子机制尚不明确，需要通过实验进一步探讨。
[参考文献]
[1] Sankaranarayanan R，Ferlay J. Worldwide burden of gynaecological cancer：the size of the problem [J]. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol，2006，20（2）：207-225.
[2] 许鹏，方玉松，朱良明，等.半乳糖凝集素-9在食管鳞状细胞癌中的表达及其与临床病理特征的关系[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2016，23（6）：824-829. [3] Shimabukuro M，Fukuda D，Sata M. Endothelial dysfunction [J]. Nihon Rinsho，2012，70 Suppl 5：236-242.
[4] 黄福海，潘丽英，徐楚燕.半乳糖凝集素-9在卵巢癌组织中的表达及其临床意义[J].安徽医药，2016，20（6）：1158-1160.
[5] 周冬梅，生秀杰，娄思园，等.BRMS1基因对卵巢癌细胞侵袭转移作用及其机制的探讨[J].中华肿瘤防治杂志，2011，18（15）：1161-1165.
[6] 赵安成.肿瘤五项标志联合检测对卵巢癌?\断的应用价值探讨[J].中华肿瘤防治杂志，2012，19（15）：1184-1186.
[7] Wada J，Kanwar YS. Identification and characterization of galectin-9，a novel beta-galactoside-binding mammalian lectin [J]. J Biol Chem，1997，272（9）：6078-6086.
[8] Fujihara S，Mori H，Kobara H，et al. Galectin-9 in cancer therapy [J]. Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov，2013，7（2）：130-137.
[9] Tureci O，Schmitt H，Fadle N，et al. Molecular definition of a novel human galectin which is immunogenic in patients with Hodgkin's disease [J]. J Biol Chem，1997，272（10）：6416-6422.
[10] 姚众，陈为亮，徐洋洋，等.半乳凝素-9抑制胶质瘤细胞增殖及迁移[J].山东大学学报：医学版，2015，53（4）：1-5.
[11] Irie A，Yamauchi A，Kontani K，et al. Galectin-9 as a prognostic factor with antimetastatic potential in breast cancer [J]. Clin Cancer Res，2005，11（8）：2962-2968.
[12] Kageshita T，Kashio Y，Yamauchi A，et al. Possible role of galectin-9 in cell aggregation and apoptosis of human melanoma cell lines and its clinical significance [J]. Int J Cancer，2002，99（6）：809-816.
[13] Liang M，Ueno M，Oomizu S，et al. Galectin-9 expression links to malignant potential of cervical squamous cell car?cinoma [J]. J Cancer Res Clin Oncol，2008，134（8）：899-907.
[14] 董超，徐正丰，邱涵，等.Galectin-9在乳腺癌组织中的表达及其对癌细胞侵袭转移的影响[J].山东医药，2016， 56（41）：81-83.
[15] 王洋.Galectin-9在结直肠癌中的表达及对NK细胞局部浸润的影响及机制研究[D].济南：山东大学，2016.
[16] 徐国荣，冯秀兰，许作鹏.Tim-3及其配体Gal-9与宫颈鳞状细胞癌病理分级和预后的相关性研究[J].中外医疗，2014（28）：63-65.
[17] Yang Q，Hou C，Huang D，et al. miR-455-5p functions as a potential oncogene by targeting galectin-9 in colon cancer [J]. Oncol Lett，2017，13（3）：1958-1964.
[18] 潘丽英，黄福海，钟雪花.Galectin-9在卵巢癌中的表达及其意义[J].中国当代医药，2016，23（11）：36-38.
（收稿日期：2017-08-30 本文编辑：张瑜杰）
发表于 2018-8-15 18:26:53