2018明胶―甲基丙烯酰基水凝胶作为生物材料在组织修复方面的应用进展

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　　[摘要]最近十年对细胞生物材料的研究已经转向三维研究。通过3D细胞培养模拟天然细胞外环境，水凝胶提供了良好的3D生物材料组织支架。因此，明胶甲基丙烯酰（Gelat in methacryloyl，GelMA）水凝胶最近受到越来越多的关注。这主要由明胶的固有生物活性和可光交联水凝胶的优点。各种研究表明GelMA是一种多功能基质，可用于从血管系统到软骨和骨工程组织的类似物。生物支架和生物培养方法的结合对于证明细胞功能或构建形状保持至再生组织的发展是很必要的。GelMA在该过程中具有关键的指导作用，并且有利于加快临床相关应用的发展。
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　　[关键词]明胶甲基丙烯酰；细胞培养；生物材料；组织工程
　　[中图分类号]R318.08 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2017）08-0130-04
　　在过去的十年中，细胞培养研究已经见证了二维向三维的转变。3D培养的细胞表现更接近于天然组织中的细胞。这种转变主要体现在水凝胶应用在组织工程中的生物材料方面的研究。在组织工程中，使用这种理想的类似于天然细胞外基质（ECM）的水凝胶刺激细胞形成具有机械整合性的功能组织，以确保移植物在植入后能继续存活。普通的生物材料通常达不到强度和机械可调性的要求，因此在当今的生物材料研究中，迫切需要一种兼有生物活性和理化性能的水凝胶。而GelMA与其他可用的水凝胶生物材料相比，能满足这些要求。这种3D细胞培养平台，不仅非常接近天然的细胞外环境，而且它为保持组织3D结构提供了可能性。3D组织类似物的这种发展反映了从单层细胞培养到盘状水凝胶中的3D培养，到经历生物成熟的生物制造3D构建体，最终可应用于修复体内组织缺陷和美容整形。
　　本文对GelMA用作细胞包封水凝胶作一概述，其可用作多种组织工程的基础材料。重点描述了在最先进的生物制造方法中获得复杂组织类似物中GelMA的应用和其在功能方面的发展，以及这种载细胞水凝胶基于工程构造的再生医学方面的用途。
　　1细胞包封
　　新兴的生物制品领域的研究目的是使用活细胞、生物活性分子、生物材料、细胞聚集体或杂交细胞材料制作生物功能性分层的3D构建体。
　　1.1明胶基水凝胶的细胞包封：明?z广泛应用于食品工业及医药加工行业。在组织工程和再生医学中，明胶是用于药物递送工程“智能”水凝胶的基础材料。明胶使用领域的增加源于它拥有的生物材料特征，包括生物相容性，生物降解性，低成本和易于操作。此外，它在临床上，常规作为血浆扩张剂和一些蛋白质制剂，也用作疫苗中的稳定剂。与胶原蛋白相比，由于热变性，明胶显示出很弱的抗原性。重要的是，用于细胞附着和基质金属蛋白酶（MMP）敏感性降解位点的胶原蛋白的生物活性序列保留在明胶骨架中。因此，通过整合素介导的细胞粘附和细胞介导的酶降解可促进细胞的迁移，增殖和分化。将明胶用作生物材料，可通过共价交联方法克服其在体温下不稳定的缺点。未修饰的明胶可用其他方式交联，以形成共价网络，例如化学交联或酶交联。化学改性后的共价交联与直接交联技术相比，向明胶主链中添加官能团是一种具有高度控制水凝胶设计和性能的交联策略。然而，只有少数方法适合同时交联和细胞包封。与间接酶交联相反，光交联能对交联过程的时间和空间进行控制，这对于创建空间复杂的组织类似物至关重要。因此，人们通常使用紫外光（UV）和可见光（VIS）进行光交联。此外，一些双重修饰可被用来改善细胞行为或增强组织成型性能。大多数报道的文献使用光引发剂Irgacure2959，与其他光引发剂相比其细胞毒性相对较低。
　　1.2明胶甲基丙烯酰水凝胶的细胞包封：GelMA由Van den Bulcke和同事于2000年首次引入。随后，由于其固有的生物活性和物理化学的可控性，使它在组织工程领域中引起相当大的热度。GelMA的水凝胶设计中的第一步是选择适当程度的明胶的官能化（Do F）。这可以通过控制用于合成GelMA大分子单体的甲基丙烯酸酐的量来调控，以此在（光）引发剂和能量源的条件下制造水凝胶。生物材料可以依据设计所需的物理化学性质进一步调控以形成特定结构。比如，可以通过增加聚合物的浓度（常规为10%）或使用接近80%的Do F的高度功能化的凝胶来阻止细胞扩散，这归功于整个水凝胶的广泛交联。通常，具有20%～80%的Do F的GelMA大分子单体可产生性能稳定的水凝胶，且随着甲基丙烯酰基取代的百分比增加，可生成硬度更大、孔径更小的水凝胶。在批量合成GelMA时，光交联的光强度，曝光时间和引发剂浓度都会影响所得水凝胶的性质。GelMA网络结构易受酶降解，特别是易受由（嵌入的）细胞分泌的MMP局部降解。所有的设计参数都需要对每个特定用途进行仔细的调控，包括硬度，降解概况和所得水凝胶中的预期细胞行为。由于GelMA性质的这种可调性，因此适用于组织工程中的许多领域。实际上，GelMA已经应用于再生神经组织、血管、软骨、骨、皮肤、骨骼肌、心脏、肝和肾等多个方面，通过各种生物加工相关技术能够得到理想的生物材料模型。
　　1.3通过微流体策略制造细胞包封模型：现在已经开发了微流体方法，以将细胞封装在GelMA液滴中，用于组织工程的各个方面。此外，引入微流控技术可制造具有包封细胞功能的光交联GelMA，它表明能通过凝胶电泳法在电极表面诱导细胞排列的办法是可行的。纤维中的这种3D模型可以用作创建组织，以直接和高通量的方式创建高度可行的含细胞的微量元件。在拉伸包封细胞的纤维后，实现与构建体中细胞的接洽。
　　1.4使用软立体光刻技术进行细胞包封：GelMA也用于各种软光刻技术中以制造能进行细胞包封的微组织模型。成功构建了以mm为尺度单位，低至100mm的分辨率，能进行细胞封装的GelMA微组织模型。通过使用光掩膜，以GelMA的微通道网络为基础构建出骨样水凝胶模型。这些方法证明细胞的局部沉积可促进骨组织的血管生成和成骨。与微流体相反，立体光刻法能够直接构建3D结构的无掩模光图案化技术。设计由软件处理并分层，通过动态立体光刻技术，可以制备具有各种形状的100～250mm薄切片，在细胞包封8小时后细胞存活率能高达80%。然而，立体光刻仅限于含有一种生物材料（混合物）和均匀分布的细胞成型。   　　1.5以含细胞的GelMA?樽橹?油墨的生物打印：除了光刻方法之外，组织类似物也可以进行生物打印。以GelMA为油墨的3D细胞来打印组织结构，最近已经成为组织工程中非常有前景的一种方法。研究人员表明，有可能通过生物打印方法直写出不同架构的GelMA结构模型。有的研究将粘度增强成分混入生物材料中可以改善用于印刷GelMA的流变学特性。例如，将吉兰糖胶或透明质酸添加到GelMA前体溶液中优化了油墨的流变性能以更好维持印刷成品的形状。或者使用增强生物材料进行共沉积。热塑性塑料如聚己内酯（PCL）在可以同时发挥这两种功效，即限定GelMA模体边界的同时增强构建体的机械性能。第三种提高细胞负载GelMA水凝胶的印刷性的方法取决于明胶固有的温度依赖性溶胶-凝胶转变。将收集板上的印刷纤维在沉积后立即冷却至5℃，以此来增强GelMA的物理交联和提供足够的机械完整性来完成逐层打印。为了制作复杂的解剖形状的构建体，可将聚乙烯醇（PVA）和藻酸盐的混合成分已经与GelMA和PCL共同打印。在制成后，除去在水溶液中被用作支撑悬垂几何形状的临时结构的混合材料，可获得临床相关尺寸的多孔结构，且在制造过程不影响细胞活力。
　　2 GelMA特性的改良
　　除了GelMA的自身性质，也可以进行生物刺激来改进细胞行为或增强机械性质。GelMA的机械性能可以是可定制的，所以可以制成一定强度和硬度的凝胶。
　　2.1可增强组织特异性功能的GelMA复合结构：在复合材料中，可以实现增强GelMA水凝胶生物材料功能的协同作用。例如，GelMA复合材料是用磷酸钙、多糖、透明质酸和ECM颗粒等物质开发的。此外，合成聚合物，如PCL、聚乙二醇（PEG）和纳米粒子也已经有与GelMA结合的研究。
　　2.2机械加固：然而，某些生物应用需要维持其生物功能性而选择低硬度时，这类水凝胶的使用就显示出它的局限性。在这些情况下，可以将GelMA与增强生物材料共混（混合打印），即将GelMA结合到3D打印支架原料上，然后凝胶和支架材料之间的共价结合，用于3Dfp刷微细纤维增强细胞的凝胶，与单独的水凝胶或纤维网相比，硬度增加了54倍。
　　3 Gel MA水凝胶的应用进展
　　GelMA对于许多组织工程策略的广泛应用强调其多功能性。然而，需要确定哪种GelMA组合类似物最适合。这可能在很大程度上取决于复合结构中GelMA的作用，其可以给予明胶的组织特异性功能。
　　3.1 GelMA在工程血管网络的应用：组织工程主要需要克服的难题是生物材料制作组织支架中，氧和营养物质的供应不足。通过引入微小血管网络组织工程材料可以解决这个问题。首先，通过使用支架，在构建体构建之后，创建一个相对直径较大的血管床，用来接种内皮细胞。第二，较小的毛细血管样结构通过内皮细胞在大块材料中的封装而产生。后一种方法是基于内皮细胞自我组装去毛细血管样结构的内在能力。
　　3.2 GelMA在组织分化领域的应用：除了用于血管化载有细胞构建体的这种普通用途之外，GelMA已经广泛用于组织特异性领域。对于心脏斑块的工程领域，将GelMA与碳纳米管和氧化石墨烯微球结合，使之具有导电性。与纯GelMA上的培养物相比，在2D复合贴片上新生大鼠心肌细胞的功能评估显示出了更高的同步跳动速率和较低的激发阈值。在肝组织工程中，肝细胞微团聚体以高通量方式增值并包封在GelMA中，含有包封肝细胞的GelMA可以作为3D肝印刷的生物源。在骨组织工程中，GelMA与磷酸钙和人类成骨细胞样细胞（MG63）结合能增加机械强度，但目前没有研究显示其对成骨性有显着影响。软骨是另一种承重组织，透明质酸直接以浓度依赖性方式影响软骨细胞分化。
　　3.3组织结构与应用：组织类似物的结构主要由（生物）功能和机械方面决定。目前，所面临的主要挑战在于将微组织模型扩大到临床相关尺寸。制作生物组织的复杂性在增加，所需要的数量也是挑战。例如，构建体的技术难点在于整个构建体的营养物质转移和保持所需的机械稳定性。此外，组织结构的一个重要方面是包含工程模拟组织的复杂性。例如，Kolesky和同事在不同的生物群中分离了不同的组织成分（脉管系统，ECM和特异性细胞）。生物制品组织的这种长期行为对于确定需要施加以获得功能性人体组织类似物的建筑复杂性的水平将是非常有价值的。
　　3.4从前临床角度看GelMA：在临床研究中获得了有希望的结果，证明了GelMA用于临床应用的潜力。软骨再生是生物材料降解和新组织替代之间平衡的一个例子，这是组织工程中的关键和最具挑战性的目标之一。GelMA降解性可以对靶组织的重塑速率进行限制。增加Do F将提高机械性能并延长所需的降解周期。对于临床应用，作为基础材料的GelMA必须满足几个要求：首先，必须考虑GelMA及其降解产物，特别是寡聚甲基丙烯酸酯的体外和体内生物相容性。临床应用中的其他挑战是不同批次的变化及与动物衍生材料相关的可能的疾病传播。尽管如此，临床级明胶现在在临床上常规使用，这表明其益处超过了风险。
　　4 Ge l MA水凝胶的未来方向
　　目前，将组织构建体应用到临床所面临的主要挑战是将再生方法转变为一定的规范程序，同时保留预期的再生能力。该转化从GelMA合成和生物打印延伸到细胞培养方案。例如，GelMA交联的金标准现在是Irgacure 2959和UV光。然而，为了避免UV光的相关缺点，可以选择可替代的交联体系，例如通过VIS，可以提高GelMA的交联度。细胞的封包进一步使GelMA的应用复杂化，因为组织工程产品需要符合高级治疗药物产品（ATMP）的立法，这种药物产品仍然是一个技术不成熟的领域。因此，GelMA不仅是将半合成生物材料转化为ATMPs的先驱，而且还可以作为一种“过渡技术”，这样可以进一步加速技术从实验室到临床的应用。在此过程中，GelMA可作为下一代组织类似物设计的基石。
　　5结论
　　GelMA作为一种组织工程生物材料近年来已经吸引人们越来越多的注意力，这归功于明胶骨架为细胞提供生物学支撑并且维持特定的物理化学性质。目前，对此类复合水凝胶的研究主要集中在3D构建体的生成或者非生物构建体的长期细胞性能研究。
　　目前所面临的最大难题是如何将构建体尺寸匹配成临床相关大小。因此，GelMA的未来研究应集中于生物制造与组织工程的互相配合，在技术成熟的前提做出尺寸合适的功能性组织等价物。智能几何形状的设计、各种材料和组织类型的组合、复杂组织的维持以及推出能参考的指南将是下一步的研究重点。
　　总之，GelMA是一种有价值、开创性的能用作生物材料以加速组织修复及各种整形美容方面的临床解决办法。