[摘要] 目的 探?长链非编码RNA HOTAIR多态位点rs7958904的遗传变异与miR-1203的关系及两者在乳腺癌细胞生长中的作用。 方法 分别将HOTAIR rs7958904野生型和突变型克隆进双荧光素酶报告载体和过表达载体，双荧光素酶报告载体分别和miR-1203模拟物共转染细胞，检测荧光素酶的表达。过表达载体、miR-1203模拟物或抑制物单独或共转染乳腺癌细胞，荧光定量PCR检测HOTAIR表达，BrdU检测细胞增殖，Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡，Transwell法检测细胞侵袭。 结果 HOTAIR突变型增强了miR-1203对其的靶向结合；miR-1203可以下调突变型HOTAIR的表达，差异有高度统计学意义（P 0.05）。野生型HOTAIR明显促进乳腺癌细胞的增殖侵袭和抑制其凋亡，突变型HOTAIR的上述作用明显减弱且可以被miR-1203阻断，差异均有高度统计学意义（P /6/view-10699773.htm
[关键词] 长链非编码RNA；HOTAIR；乳腺癌；miR-1203；单核苷酸多态性
[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）01（c）-0008-05
[Abstract] Objective To investigate the association between genetic variation of lncRNA HOTAIR SNP rs7958904 and miR-1203， as well as to explore their roles in the growth of breast cancer （BC） cells. Methods The wild type and mutant HOTAIR SNP rs-7958904 were both cloned into the Dual-Luciferase Reporter Vector and Over-expression vector， respectively. The Dual-Luciferase Reporter Vectors and miR-1203 mimics were co-transfected into the cells， and then the luciferase expression was detected. Furthermore， BC cells were transfected with the overexpression vector and/or miR-1203 mimics/inhibitors. And then， HOTAIR expression was detected by fluorescent quantitative PCR， cell proliferation was assessed by BrdU， cell apoptosis was tested by Annexin V-FITC/PI， and cell invasion was examined by Transwell Assay. Results The binding of miR-1203 and HOTAIR was enhanced by mutant HOTAIR； miR-1203 could down-regulate the expression of mutant HOTAIR （P 0.05）. The wild-type HOTAIR promoted the proliferation and invasion of BC cells significantly but inhibit their apoptosis （P 乳腺癌（breast cancer，BC）是女性肿瘤中最常见的一种，其发病率在各种女性恶性肿瘤中居于首位，并且逐年上升[1]。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一种无蛋白编码能力的功能性RNA分子，研究表明lncRNA在肿瘤发生发展中发挥重要作用[2]。目前研究发现，同源盒基因转录反义RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）在大多数肿瘤中呈现高表达，且在肿瘤中发挥重要作用[3-5]。
LncRNA的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）不单会改变lncRNA的结构和稳定性而影响其表达，也有可能影响miRNA-lncRNA间的相互作用而调控其功能发挥，从而影响个体的肿瘤易感性[6-8]。但目前关于lncRNA SNP与乳腺癌间的关联研究还很少，因此探讨lncRNA SNP在个体乳腺癌易感性中的研究具有重大意义。根据预测，HOTAIR rs7958904位点上的G/C突变可增加miR-1203的结合位点。因此，本研究具体探讨HOTAIR rs7958904位点是否能通过miR-1203而影响乳腺癌细胞的生长及机制。
1 材料与方法
1.1 细胞培养
人乳腺癌MDA-MB-231细胞购自美国ATCC细胞库，用含10%胎牛血清（购自杭州四季青）和双抗的RPMI-1640培养基（购自Gibco公司）置于37℃、5% CO2、?和湿度培养箱中进行培养，每隔3 d用胰酶消化传代。
1.2 过表达载体构建和转染
HOTAIR野生型过表达载体购自广州复能公司，突变型HOTAIR过表达载体用QuikChangeⅡSite-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene）试剂盒进行。转染前1 d，细胞接种6孔板，接种浓度为1×105个细胞/mL，每孔1 mL；第2天当细胞汇合度达到70%左右时进行转染，质粒转染量为4 μg/孔，步骤参考Lipofectamine 2000（Invitrogen）说明书进行；转染后4～6 h换液，48 h后进行后续实验检测。
1.3 双荧光素酶报告基因检测
HOTAIR野生型和突变型全长序列分别克隆到双荧光素酶报告载体psiCHECK-2（Promega）中，然后分别和miR-1203模拟物（购自广州市锐博生物科技有限公司）共转染细胞。转染48 h后，用双荧光素酶报告基因检测系统（Promega）进行荧光强度测定，用萤火虫荧光素酶为内参进行校正，从而得出相对的荧光强度比，并将数据进行分析。
1.4 荧光定量PCR
收集细胞用Trizol提取总RNA，定量后用1 μg RNA进行逆转录，SYBR-Green染料法（SYBR Green PCR Master Mix购自TOYOBO）进行定量PCR，20 μL体系含100 ng cDNA。反应条件为：95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40 cycles。每个样重复3次，定量分析通过比较2-ΔΔCt值进行。
1.5 细胞增殖
用BrdU ELISA kit（Roche）进行检测。细胞接种于96孔板中，转染后继续培养48 h。去除培养基，加入20μL BrdU标记液，继续培养3 h细胞固定后，加入过氧化物酶标记的BrdU抗体孵育90 min。继续加入过氧化物酶底物，在酶标仪上以370 nm/492 nm 双波长检测吸光值，即BrdU掺入量。每组设3个复孔。
1.6 细胞凋亡
转染48 h后收集细胞，按Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）说明书操作，加入500 μL Binding Buffer悬浮细胞；加入5 μL Annexin V-FITC混匀后，再加入5 μL Propidium Iodide，混匀；室温、避光、反应5～15 min，用流式细胞仪进行检测，实验重复3次。
1.7 细胞侵袭
往Transwell小室中铺上Matrigel（BD），细胞转染后第二天进行悬浮，调整细胞密度至1×106个细胞/mL，取200 μL加入Transwell小室上室，在下室加入600 μL完全培养基；37℃、5% CO2孵育48 h后，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤1次，结晶紫染色10 min，PBS洗涤1次，拍照计数分析。
1.8 统计学方法
采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，采用析因设计方差分析比较各组间体外细胞增殖、凋亡及侵袭能力的差异；采用单因素方差分析（one-way ANOVA）比较各组荧光定量PCR检测结果；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P C等位基因突变可增加一个新的miR-1203结合位点（图1A）。进一步的双荧光素酶报告基因实验表明（图1B），突变型HOTAIR载体与miR-1203共转染时，荧光素酶表达较NC miRNA转染组明显下调，差异有高度统计学意义（P 0.05）。这说明，G>C等位基因突变可明显增强miR-1203与HOTAIR的结合。
2.2 不同亚型HOTAIR的表达
分别将HOTAIR野生型和突变型过表达载体转染乳腺癌细胞，HOTAIR表达均上调明显（P 2.3 miR-1203和不同亚型HOTAIR对细胞增殖的影响
单独转染miR-1203模拟物时，乳腺癌细胞增殖明显下调，而野生型和突变型HOTAIR均会促进乳腺癌细胞的增殖，但突变型HOTAIR的促增殖效果明显低于野生型HOTAIR（图2B），以上差异均有高度统计学意义（P 0.05），只是略低于对照组（图2B）。而突变型HOTAIR与miR-1203抑制物共转染时，细胞增殖显著增强（P 0.05）。但共转染突变型HOTAIR与miR-1203抑制物时，细胞侵袭显著下调（P 参考文献]
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（收稿日期：2017-10-10 本文?辑：任 念）
发表于 2018-8-14 22:22:13