2018基于核酸适配体-金纳米粒子比色传感器快速检测食品中赭曲霉毒素A

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　　摘 要：本研究以核酸适配体为识别元件实现对赭曲霉毒素A（OTA）的高选择性识别，以及采用金纳米粒子做为比色探针，建立了适用于OTA快速检测的比色适配体传感器。研究结果表明，该比色传感器对OTA具有较高的灵敏度和特异性，操作简单快速，能用于实际食品样品中OTA的快速筛查检测；该比色传感器在520nm和650nm下吸光度的比值（A520/A650）与OTA浓度在0.05～5μM的范围内呈线性相关，检测限为0.02μM。
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　　关键词：核酸适配体 金纳米粒子 比色传感器 赭曲霉毒素A
　　前言
　　赭曲霉毒素是由多种曲霉和青霉菌产生的一类化合物，包括赭曲霉毒素A、B、C、D，4种结构类似的化合物，其中毒性最大、与人类健康关系最密切、对农作物的污染最重、分布最广的是赭曲霉毒素A（OTA）[ 1 ]。OTA以污染粮谷类农作物为主，但相继有报道指出，许多其他种类的食品中也检测出了OTA，如水果、葡萄酒、啤酒、咖啡、可可和巧克力、中草药、调味料等多种植物产品和食品。由于生物蓄积作用，如许多动物性食品尤其是肾脏、肝脏、肌肉、血液，以及乳和乳制品中常有OTA检出[ 2 ]。
　　OTA在食品中的含量通常较低，但较低含量时就可危害人体健康，因此建立一种具有一定灵敏度与专一性，且简便实用，便于推广的OTA快速检测方法具有重要意义。目前应用最广泛的OTA检测方法是高效液相色谱法（HPLC）及高效液相色谱质谱联用法[ 3 ]，但这些方法存在着前处理复杂，样品提取繁琐、净化过程及检测周期长、仪器昂贵、检测成本高等缺点，而无法用于大量样本的快速筛查。
　　核酸适配体是新近发展起来的一类由指数富集配基系统进化技术（SELEX）筛选产生的单链DNA或RNA片段，能特异性地结合小分子蛋白质、多肽、有机物、金属离子等各种配体，其作为识别分子在医疗诊断、环境检测、基础分析等多种技术中得到了广泛应用。金纳米粒子具有独特的光学特性，小粒径金纳米粒子（10～100nm）水溶胶一般呈红色，当金纳米粒子由于外在的作用发生聚集时，其吸收峰将变宽并发生红移，其颜色也由红色变为蓝紫色。依据这一现象，将以核酸适配体为识别元件与以金纳米粒子为比色探针相结合，构建的适配体比色探针广泛地用于各种生化检测，检测目标包括生物大分子、癌细胞、金属离子以及有机小分子[4]。
　　本研究开发了一种“双链复合物”模式的比色探针，通过核酸适配体将金纳米粒子连接在一起发生团聚，随着OTA与核酸适配体的结合，DNA链发生解链，连接在一起的金纳米粒子由于静电作用重新分散于溶液中，溶液颜色相应发生改变，从而实现食品中OTA的快速灵敏检测。
　　1 实验部分
　　1.1 仪器和试剂
　　UV-2450紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；XS105DU型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli-Q纯水机（美国Millipore公司）。
　　氯金酸（HAuCl4）为分析级，购自于美国Sigma公司；赭曲霉毒素A购自于美国Romer公司；甲醇（HPLC级，德国Merck公司）；其余试剂均为分析纯，实验用水是超纯水（>18 MQ）。
　　包含核酸适体的DNA寡聚核苷酸（连接链）和两条与之部分互补的DNA寡聚核苷酸（分别在3’端和5’端进行巯基修饰）均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其序列如下：
　　连接链（粗斜体为OTA适配体部分）：5’-ACTCATCTGTGAAGA？GATCGGGTGTGGGTGGCG TAAAGGGAGCATCGGACA -3’；5’端巯基化DNA：5’-HS-CACCCGATCTCT-3’；3’端巯基化DNA：5’-TCACAGATGAGTA10-SH-3’；使用前3种DNA链分别用水溶解，配制成100μM的溶液。
　　1.2 金纳米粒子的制备
　　利用柠檬酸钠还原法合成实验用的金纳米粒子。具体方法如下：将100mL新鲜配制的1mM的HAuCl4溶液加入到锥形瓶中，于恒温电磁搅拌器上加热沸腾2min，然后迅速加入2mL质量分数为5%的柠檬酸钠溶液，继续搅拌，加热保持沸腾10min，使溶液的颜色由淡黄色变为酒红色，停止加热，搅拌使其冷却至室温，然后将制备的纳米金溶液装入棕色试剂瓶中，置于4℃冰箱中保存备用。
　　1.3 核酸适配体-金?{米粒子探针的制备
　　取5’端巯基化DNA以及3’端巯基化DNA的溶液各100μL加入10mL纳米金溶液中，搅拌均匀后，在室温下放置12h，使DNA链通过Au-S键结合到纳米金表面，再加入100μL的包含核酸适配体连接链溶液，混合均匀后，将溶液加热至94℃ 2min，快速冷却至30℃，保持30min，使包含核酸适配体连接链与纳米金表面结合的DNA杂交。然后在16000rpm下离心15min，以去除多余的、没有和纳米金结合的DNA链，加水清洗后再次离心，将制备的核酸适配体-金纳米粒子探针用10mL浓度为20mM pH=8.5的磷酸盐缓冲溶液（PBS）分散，4℃冰箱保存备用。
　　1.3 核酸适配体-金纳米粒子比色探针对OTA的检测
　　OTA标准溶液：用甲醇将OTA溶解配制成1mM的标准储备溶液，临用前用PBS稀释成不同浓度的测试液。
　　实际样品中OTA的提取：将不含OTA的玉米样品彻底粉碎后，加入不同浓度的OTA样品，充分混匀。称取5g加标样品，加入20mL 80%的甲醇水溶液作为提取液，涡旋混匀后震荡提取30min，离心后将上清液用氮气吹干，加入200μL甲醇溶解后，加PBS缓冲溶液稀释至1mL，通过0.45μm的微孔滤膜过滤后作为测试液。
　　OTA测定：将500μL核酸适配体-金纳米粒子探针加入测试管中，再加入500μL待测液，用振荡器混匀，静置反应15min分钟，即可用肉眼观察颜色变化，实现对OTA的快速定性检测，用紫外可见分光光度计扫描反应后的溶液，利用加入OTA后吸光度的变化，实现对OTA的快速定量检测。   　　2 结果与讨论
　　2.1 检测原理
　　本研究制备的“双链复合物”模式的比色探针的基本原理如图1所示：
　　通过两条末端巯基化且与OTA核酸适配体部分互补的DNA链对金纳米粒子进行功能化处理，OTA核酸适配体链作为连接链，与两条部分互补链杂交，使功能化的金纳米粒子发生聚集，当溶液中加入OTA时，OTA与核酸适配体的结合，使其DNA构象发生改变，从而造成适配体链与互补的DNA链发生解链，团聚的金纳米粒子由于静电作用重新分散于溶液中，颜色由蓝紫色变成红色。基于这一原理，可以构建一种比色法来快速灵敏地检测食品中赭曲霉毒素A。
　　利用投射电子显微镜（TEM）对核酸适配体-金纳米粒子探针加入OTA前后的微观形态进行表征，从图1可以看出，通过DNA双链的形成，在探针溶液中金纳米颗粒形成团聚物，加入OTA后，由于核酸适配体链与OTA的结合，DNA双链入OTA浓度的升高，溶液逐渐变成酒红色，根据颜色变化，可以实现对OTA的定性及半定量检测。而在探针溶液中加入较高浓度（10μM）的赭曲霉毒素B（OTB）后，溶液颜色仍然为蓝色，这一结果说明核酸适配体-纳米粒子探针对于OTA具有良好的特异性。
　　2.3 定量检测OTA
　　核酸适配体-纳米粒子探针溶液对OTA响应过程的颜色结构被破坏，团聚的金纳米粒子由于静电作用在溶液中变回分散态。
　　2.2 目测比色法快速检测OTA
　　利用核酸适配体-纳米粒子探针溶液的颜色变化，可以对样品中的OTA毒素进行快速检测。如图2所示，在核酸适配体-金纳米粒子探针溶液溶液中，团聚的金纳米粒子使溶液呈蓝色，加入0.5μM的OTA后，溶液变成紫红色，随着加变化可以通过分光光度计来测定。金纳米粒子的团聚使核酸适配体-纳米粒子探针溶液在650nm左右有较宽的吸收峰，随着OTA与核酸适配体的结合，金纳米颗粒重新分散在溶液中，其吸收光谱在520nm处出现一个特征吸收峰，随着OTA浓度的升高，650nm下的吸光度（A650）不断降低，而520nm下的吸光度（A520）不断增大，两个波长下的吸光度比值A520/A650与OTA的浓度在0.05～5μM的范围内，呈线性相关，线性相关系数为0.996。以空白溶液的3倍标准偏差计，OTA的检出限为0.02μM。对于加标浓度分别为5、10、50μg/kg的玉米粉进行加标测定，回收率在75%～102%之间，相对标准偏差在3.8%～9.6%之间。
　　3 结论
　　本研究基于核酸适配体作为生物识别元件，金纳米粒子作为比色探针，建立了一种适用于OTA检测的比色适配体传感器，本实验方法操作简单，灵敏度高，特异性强，根据溶液颜色变化，肉眼观察即可对样品中OTA进行灵敏检出，通过分光光度计对溶液吸收光谱的变化可以??OTA进行准确地定量检测，实际样品分析检测表明该方法可用于食品中快速筛查检测。参考文献：
　　[1] 疏秀林，施庆珊，欧阳友生.赭曲霉毒素的产生及鉴别[J].中国卫生检验杂志，2008，10：2183-2185.
　　[2] 李凤琴，计融.赭曲霉毒素A与人类健康关系研究进展卫生研究[J].2003，32（2）：172-175.
　　[3] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.GB5009.96-2016.食品安全国家标准 食品中赭曲霉毒素A的测定.2016.
　　[4] Song S， Wang L， Li J， Zhao J， Fan C. Aptamer-based biosensors[J]. Trends in Analytical Chemistry. 2008， 27： 108-117.