2018慢性应激抑郁型黄褐斑小鼠模型的建立

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　　[摘要]目的：根据黄褐班主要发病因素，综合作用于小鼠建立抑郁型黄褐斑小鼠模型，并与现有方法建立的模型进行比较。方法：取小鼠30只，随机分为3组：正常组6只、紫外线组12只、紫外线+黄体酮+抑郁组12只。造模时间第一批21d，第二批28d，然后对各组小鼠皮肤和肝脏SOD、MDA含量，皮肤黑色素细胞个数、数密度和平均光密度值进行统计分析。结果：黄体酮+紫外线+慢性应激抑郁模型建立法造模较其他方法更能导致皮肤丙二醛（Malondialdehyde，MDA）升高和超氧化物歧化酶（superoxide Dismutase，SOD）降低以及皮肤黑色素细胞的增加，差异均有统计学意义（P /6/view-10121418.htm
　　[关键词]黄褐斑；抑郁型；小鼠模型；丙二醛；超氧化物歧化酶
　　[中图分类号]R758.4+2 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）02-0094-04
　　黄褐斑是一种由多种因素综合作用所致的色素代谢异常性疾病，其发病机理复杂，具体病因尚不十分清楚。国内外研究显示紫外线辐射、内分泌失调、情绪变化、肝病、化妆品使用不当等都是黄褐斑的重要致病因素。长期紫外线照射可使黑素细胞增殖，而黑色素的生成是酪氨酸酶一系列氧化反应的结果，提示体内氧化与抗氧化之间的平衡紊乱。相关实验证实黄褐斑患者较正常人的脂质过氧化物（Lipid peroxide，LPO）升高、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）下降，故可以通过皮肤黑色素病理形态学，LPO的衍生物丙二醛（Malondialdehyde，MDA）及SOD量的变化证实黄褐斑模型的成功。本课题根据黄褐斑的主要发病因素，拟对小鼠局部行紫外光照射，内用雌激素全身攻击，同时采用慢性应激刺激致小鼠出现抑郁症状，在多重因素综合作用下构建小鼠黄褐斑模型，并与原有模型建立结果相比较。
　　1材料和方法
　　1.1实验动物：健康雌性BALB/C小鼠30只，清洁级，体质量（20±2）g，由军事医学科学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK-（军）2002-001。
　　1.2试剂和器材：黄体酮注射液（20mg/ml，使用前用灭菌注射用水稀释至所需浓度）；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20060110）；丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20060116）；HMB45（melanoma黑素瘤）abcam鼠单克隆抗体（购自武汉华美生物工程有限公司）。DuaLightTMUVA/UVB高能紫外光治疗仪。
　　1.3实验方法
　　1.3.1分组：取小鼠30只，随机分为3组：正常组6只、紫外线组12只、紫外线+黄体酮+抑郁组12只。造模时间第一批21d，第二批28d。第一批：正常组6只、紫外线组6只、紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组6只；第二批：紫外线组6只、紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组6只。
　　1.3.2模型建立
　　1.3.2.1正常组：先在小鼠颈背部涂肥皂水，以剃须刀片刮去背部毛，露出约1.5cm×1.5cm的皮肤1块。每周脱毛1～2次，每天肌肉注射注射用水5ml/kg，连续观察小鼠脱毛部位的皮肤变化情况。
　　1.3.2.2紫外线组：脱毛步骤同正常组，先通过预实验得到BALB/C小鼠长波紫外线最小光毒量（Minimal phototoxicdose，MPD）为7J，中波紫外线最小红斑量（Minimalerythemal dose，MED）为480mJ。第1天以0.7MPD+0.7MED中波紫外线UVA（7J）+UVB（480mJ）每天照射1次，连续照射6d，第7天小鼠皮肤出现轻微结痂脱屑，停止照射2d；第9天以0.5MPD+0.5MED照射1次，第10天皮肤出现红斑，停止照射2d：第12天以0.5MPD+0.5MED照射1次，第13天皮肤出现红斑，停止照射3d；第16天以0.25MPD+0.25MED照射1次，第17天皮肤出现红斑，停止照射2d；第19天以0.25MPD+0.25MED照射1次，第20天皮肤出现红斑，停止照射2d。第一批：照射21d。第二批：照射21d后，停止照射7d。
　　1.3.2.3黄体酮+紫外线+抑郁组：同正常组脱毛处理，紫外线照射方法同紫外线组。每日8：00～9：00注射黄体酮注射液，使用前用灭菌注射用水稀释至所需浓度，每日肌肉注射0.4%黄体酮5ml/kg。慢性轻度不可预见性应激（chronic unpredictd mild stress，CUMS）抑郁模型制作方案：按照经典抑郁模型略加改进为2h行为限制、4℃冰水中游泳5min、停水4h、停食24h、夹尾1min、明暗颠倒24h、摇晃5min（160Hz）、笼子倾斜45°、40℃环境5min，共9种刺激随机安排到21d内，每天1种刺激，每种出现2～3次，同种刺激不能连续出现避免动物预料刺激的发生。
　　1.4检测指标和方法
　　1.4.1皮肤黑色素细胞的病理形态学观察：第一批小鼠当脱毛部位皮肤出现明显的色变（照射21d），取去毛皮肤1块（1cm×1cm），10%福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋切片，经脱蜡至水，抗原修复，用HMB45（melanoma黑素瘤）为第一抗体，二氨基联苯胺（Diaminobenzidine，DAB）显色，苏木素复染，用PBS代替一抗做阴性对照。第二批小鼠在实验28d后处死取皮，余步骤同上。黑色素阳性目标用计算机进行?D像分析，每片观察5个不同视野，找到阳性目标后应用空军总医院与北京航空航天大学共同研制的CMIAS多功能真彩色病理图像分析系统，进行病理图像形态学定量分析，步骤如下：每张切片在显微镜物镜40倍视野下，随机选择5个视野进行彩色图像采集与存储，计算出每个视野的形态学阳性目标（靶目标）中的数密度及光密度参数。光密度反应物体对光的吸收率（透过率），反应物体颜色的深浅程度。颜色越深，其对光线的吸收越多，故光密度越高。积分光密度是物体的平均光密度与物体面积的乘积，颜色越深，面积越大，光密度越高。   　　1.4.2MDA和SOD活性测定：同时取肝脏及脱毛部位皮肤，用预冷生理盐水（4℃）冲洗，除尽杂质，拭干，切取皮肤0.2g，肝脏0.5g，分别放入有9倍于组织块的预冷生理盐水的小试管内，将剪碎的组织倒入玻璃均浆管中，上下转动研磨数十次，充分研碎，使组织均浆化。均浆后以3500r/min离心8min，取上清液采用试剂盒检测MDA、SOD活性。
　　1.4.3行为学实验
　　1.4.3.1旷场实验：于第22天清晨8：00，在无噪声的实验环境条件下进行。操作者握住小鼠的尾巴根部1/3处，轻轻将小鼠放入6cm×9cm×9cm的长方形实验盒内的中央格，并开始计时。底部均分为6格（3×3），分别观察并记录3min内小鼠行走的格数和直立的次数。实验要求在单盲的条件下进行，减少人为误差。观察指标：穿格次数、理毛次数、直立次数。共进行4次，每次间隔3min，取后3次数据计算平均数用于统计分析。
　　1.4.3.2体质量变化测定：实验开始及结束时分别测量小鼠的体质量。
　　1.4.3.3液体消耗试验：试验前，在隔噪音、安静的房间内，训练动物适应含糖饮水，每笼同时放置2个水瓶，第一个24h，两瓶均装有1%蔗糖水，随后的24h，一瓶装1%蔗糖水，一瓶装纯水。23h的禁食禁水后，进行动物的基础糖水/纯水消耗试验，同时给予每只小鼠事先定量好的两瓶水：一瓶1%蔗糖水，一瓶纯水。24h后，取走两瓶水并称重。计算动物的总液体消耗量、糖水消耗量、纯水消耗量及糖水偏爱度（糖水偏爱=糖水消耗/总液体消耗×100%）。1.5统计学分析：采用统计学软件SPSS 21.0，用（x±s）表示各组小鼠皮肤和肝脏SOD、MDA含量、皮肤黑色素细胞的个数、数密度和平均光密度值等计量资料，行t检验，检验水准α=0.05。
　　2结果
　　2.1三组小鼠皮肤黑色素细胞的病理形态检测结果：空白组：鳞状上皮较菲薄，由排列整齐的基底细胞和棘细胞组成，共2～3层，表面有少量角质；真皮中可见毛囊，皮脂腺与表皮相连，未见汗腺：HMB45标记表皮中几乎未见黑色素细胞，毛囊、皮脂腺基底细胞中见少量黑色素细胞，见图1。紫外线组：HMB45标记的黑色素阳性细胞少量增多，分布于毛囊基底细胞团中，呈阳性反应，表皮基底细胞和棘细胞层中亦见单个散在分布的黑色素细胞，伴细胞核增大及上移，见图2。黄体酮+紫外线+抑郁组：HMB45标记的黑色素阳性细胞明显增多，成簇分布于毛囊基底细胞团中，呈强阳性反应，表皮基底细胞和棘细胞层中亦见单个散在分布的黑色素细胞，伴细胞核增大及核上移，见图3。
　　2.2五组小鼠皮肤黑色素细胞个数检测结果：由表1可知，模型组小鼠皮肤黑色素细胞的个数均较正常组有所增加，其中黄体酮+紫外线+抑郁21d组与正常组比较，差异有统计学意义（P