2018外源性硫化氢对去卵巢骨质疏松大鼠骨代谢及护骨素/细胞核因子的
骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种代谢性骨骼疾病，以骨量减少、骨质丢失、骨微观结构退化、脆性增加和易发生骨折为特征。OP多发于60岁以上老年人，尤其是绝经后的妇女发病率更高，称为绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，PMOP）。目前的研究认为PMOP的发生与体内雌激素的减少有关，因此对PMOP的治疗目前多采用的激素替代疗法，但是激素替代疗法可能增乳腺癌和子宫内膜癌的风险，因此寻找新的防治PMOP的途径具有十分重要的意义。硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）是一种具有腐臭鸡蛋气味的气体，被认为体内的第三种气体信号分子。H2S在体内广泛分布，心血管、内脏、神经系统和骨骼均有分布。H2S具有广泛的生理作用，也参与了许多疾病的发生发展。研究显示H2S能保护氧化应激诱导的成骨细胞的损伤，保护成骨细胞的功能。因此本研究选择去卵巢大鼠作为研究对象，模拟PMOP，用硫氢化钠（sodium hydrosulfide，NaHS）作为外源性H2S的供体，观察外源性H2S对PMOP的影响，并从护骨素（osteoprotegerin，OPG）和细胞核因子кB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL）系统的角度探讨H2S抗OP的可能机制。1 材料与方法
1.1材料
NaHS（Sigma公司），雌二醇（E2）放免法检测试剂盒（北京东雅生物工程公司），尿钙邻甲酚酞络合酮法检测试剂盒（南京天鼎生物技术研究所），脱氧吡啶啉ELISA法检测试剂盒（上海亿欣生物科技有限公司），BCA蛋白定量试剂为Pierce公司产品，兔抗鼠OPG、破骨细胞分化因子（RANKL）和磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）抗体以及辣根过氧化物酶标记二抗（美国Santa Cruz公司），LUNAR-DPXIC型骨密度仪（GE公司），HITACH717全自动生化分析仪（日本日立公司），全自动计数仪（上海第二仪器厂），MRXⅡ型酶标仪（美国Dynex公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 动物模型制备和分组 清洁级成年雌性健康未交配SD大鼠50只，6个月龄，体重（25020）g，由南华大学实验动物学部提供。大鼠适应性喂养1周后，于术前禁食过夜，自由饮水；选取其中40只大鼠用3.6%水合氯醛（10 mL/kg体重）腹腔注射麻醉，仰面固定，腹部常规消毒，做腹正中切口，找到双角子宫，沿子宫找到双侧卵巢，分离周围脂肪组织，完整摘除双侧卵巢。术后待大鼠自然清醒，青霉素（4万U/只）治疗3 d。双侧卵巢切除大鼠随机分成四组：去卵巢模型组、NaHS组（10、50、100 mol/kg）处理组，每组10只。剩下10只大鼠为对照组，进行假手术，不切除双侧卵巢。NaHS组大鼠腹腔注射用生理盐水溶解的NaHS，对照组和模型组给予等量生理盐水。大鼠由专人饲养，自由进食和饮水，12 h光照，温度控制在（223）℃。实验期为12周，实验过程中没有大鼠死亡。
1.2.2 骨代谢相关生化指标测定 实验结束后，3.6%水合氯醛（10 mL/kg体重）腹腔注射麻醉，打开胸腔，心脏放血，处死大鼠。留取膀胱中的尿液，采用邻甲酚酞络合酮法测定尿钙水平，采用ELISA方法测定尿脱氧吡啶啉（deoxypyridinoline，Dpd）水平，结果以每mmol肌酐（Cr）表示。取血清，用全自动生化分析仪测定血清钙、磷和血碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）水平，采用放免法测量血清E2水平。
1.2.3 股骨骨密度（boneminaral density，BMD）检测 实验结束大鼠处死后，迅速剔出大鼠的股骨，剔除周围的软组织，将右侧股骨用盐水纱布包裹置于冻存管中放入-80 ℃保存。然后用LUNAR-DPXIC型骨密度仪，采用双能X线吸收法测量大鼠右侧股骨中段的骨密度。
1.2.4 蛋白质印迹法检测OPG和RANKL表达 大鼠处死后，迅速剔出大鼠的股骨，剔除周围的软组织，在-80℃保存。[(www. ) 专业提供论文代写和发表的服务,欢迎光临]取股骨组织约200 mg，加1 mL细胞裂解液Buffer匀浆机中磨碎匀浆。4 ℃，2000 r/min离心30 min，取出上清液。采用总蛋白提取试剂盒按说明操作提取股骨组织总蛋白。BAC法测定蛋白浓度。取100 L蛋白质样本加入2SDS凝胶加样缓冲液中煮沸使蛋白质变性。用6%SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳1 h分离蛋白，将分离的蛋白用半干转膜仪转移至PVDF膜上，丽春红染色观察转移效果。10%脱脂牛奶室温下封闭2 h，加入兔抗鼠OPG（1∶200）和RANKL（1∶150）一抗，4 ℃过夜。TBST洗膜3次后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下孵育2 h。蛋白质印迹荧光检测试剂盒显示于X线光片，经显影、定影后凝胶图像分析系统对胶片扫描，进行半定量分析。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数标准差（xs）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 H2S对去卵巢OP大鼠骨代谢相关指标的影响
与对照组比较，去卵巢OP模型组大鼠血清E2水平显著降低，差异有统计学意义（t = 5.74，P0.05）；NaHS（10、50、100 mol/kg）组与对照组比较，差异无统计学意义（P0.05），提示NaHS没有影响大鼠体内的E2水平。与对照组比较，去卵巢OP模型组大鼠尿钙、尿Dpd、血清钙、血清磷和ALP水平显著增加，差异均有统计学意义（t = 4.65、3.81、3.98、4.31、4.47，均P0.05）。与去卵巢OP模型组比较，NaHS（50、100 mol/kg）组大鼠尿钙、尿Dpd、血清钙、血清磷和ALP水平显著降低，差异均有统计学意义（F=4.67、3.92、3.89、4.23、4.15，均P0.05）。见表1、2。
表1 各组大鼠血清雌二醇、尿钙和尿脱氧吡啶啉水平比较（xs）
注：与对照组比较，*P0.05；与去卵巢OP模型组比较，#P0.05；OP：骨质疏松；NaHS：硫氢化钠
表2 各组大鼠血清钙、血清磷和碱性磷酸酶水平的变化（xs）
注：与对照组比较，*P0.05；与去卵巢OP模型组比较，#P0.05；OP：骨质疏松；NaHS：硫氢化钠
2.2 H2S对去卵巢OP大鼠BMD的影响
双侧卵巢切除后12周后取各组大鼠右侧股骨，用双能X线吸收法分别测定各组大鼠右侧股骨中段的BMD。结果如图1所示：与对照组比较，对去卵巢OP模型组大鼠股骨的BMD显著降低[（0.25&plus
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