2018促红细胞生成素类似结构对大鼠心肌缺血损伤的保护作用和预防机制
近年来随着药物溶栓冠状动脉介入术、冠状动脉旁路移植术等治疗方法的临床应用，使受损心肌得到及时再灌注，明显降低了急性心肌梗死的病死率。但缺血的心肌再灌注时也引起一系列心脏与血管的不良事件，有研究显示，促红细胞生成素（rhEPO）可能发挥潜在的抗心肌细胞凋亡和促进血管新生等作用，从而发挥对缺血再灌注心肌的保护作用。但由于促红细胞生成素同时具有促血小板聚集血栓形成的风险，难以应用于临床。在对促红细胞生成素三级结构研究中发现，促红细胞生成素类似结构、促红细胞生成素B螺旋结构表面缩氨酸（pHBP）是红细胞生成素三级机构中的部分区域结构，分子量为1257，无促血小板聚集作用，保留组织保护结构区域，与组织保护的受体相结合。本实验拟探讨pHBP在心肌缺血损伤中是否具有心脏保护作用及可能机制。1 材料与方法
1.1 实验材料
取10周左右雄性SD大鼠80只，体重（20020）g，由南昌大学动物实验中心提供。乳酸脱氢酶（LDH）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）检测试剂盒购自武汉亚法生物制品有限公司，重组人红细胞注射液购自沈阳三生有限制药公司，兔抗p44/42 MAPK、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG均购自美国Santa生物公司。pHBP由Araim Pharmaceutical购得。
1.2动物分组及模型建立
参考赵秀梅等的垫扎球囊法制作大鼠缺血再灌注（I/R）模型，实验动物分为4组。假手术组（n=20），丝线穿过冠状动脉左室支但不结扎，经尾静脉注射生理盐水；I/R组（n=20），建立动物模型后5 min后通过尾静脉接受静脉注射注射生理盐水1 mL/kg；I/R+pHBP组（n=20），建立动物模型后5 min后通过尾静脉接受静脉注射pHBP 1 g/kg；I/R+rhEPO组（n=20），建立动物模型后5 min后通过尾静脉接受静脉注射注射rhEPO 3000 U/kg。
1.3 生化指标检测
I/R 120 min后自腹主动脉取血6 mL，静置30 min，4℃下，以离心半径5 cm，3000 r/min离心10 min，分离血清。按照试剂盒说明采用化学比色法测定血清乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）含量。
1.4 心肌梗死面积测定
存活大鼠在制模24 h后处死，取新鲜大鼠心脏，用PBS缓冲液冲洗，滤纸吸干，-20℃冰冻30 min 后将其横断面切成1～2 mm切片，1% TTC 37℃染色25 min，切片放4%甲醛中过夜以增强颜色对比，非心肌梗死区染色为红色，梗死区不染色。扫描仪扫描心脏切片，使用image proplus 6.0软件测量相关区域面积，梗死面积（%）=左心室组织切片梗死区面积/左心室组织切片总面积100%。
1.5 Western blot法检测p44/42蛋白表达
手术处理后的存活大鼠在制模后3、24 h进行处死。可以通过组织颜色改变鉴别心肌缺血组织和正常组织，进行组织切片放入液氮冷冻心肌梗死组织标本将通过Western blot方法测定p44/42 MAPK，分别取各组心肌组织，提取总[(www. ) 专业提供论文代写和发表的服务,欢迎光临]蛋白，收集上清液，考马斯亮蓝法进行担保定量。SDS-PAGE分离样品后电泳转移至硝酸纤维膜上，TBST常温下封闭过夜后，分别加入anti-NF-B小鼠单抗（一抗）、室温下免疫沉淀1 h，加入加入辣根酶标记兔抗山羊IgG（二抗）2 h。洗膜，显色。具体实验方法参照文献，实验胶片扫描后用Image J软件进行图像分析，以-actin（1∶1000稀释）作为内参照对比，比值结果表示其蛋白的相对含量，用Gel-ProAnalyzer分析软件分析通道蛋白的灰度值。
1.6 统计学方法
采用SPSS 15.0 统计软件处理。正态分布计量资料以均数标准差（xs）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用2检验。以P0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组心肌LDH、CK-MB水平的比较
与假手术组比较，I/R组LDH、CK-MB含量明显增加，差异有统计学意义（P0.05）。I/R+rhEPO组、I/R+pHBP组LDH、CK-MB含量减少，两组差异无统计学意义（P0.05）；与I/R组比较，差异均有统计学意义（P0.05），提示pHBP组具有与rhEPO组相似的心肌保护作用。见表1。
表1 各组乳酸脱氢酶、肌酸激酶同工酶水平（U/L，xs）
注：与假手术组比较，*P0.05；与I/R组，#P0.05；I/R：缺血再灌注；rhEPO促红细胞生成素；pHBP：促红细胞生成素类似结构；LDH：乳酸脱氢酶；CK-MB：肌酸激酶同工酶
2.2 各组心肌梗死面积情况
假手术组的心肌梗死面积为0.00%，I/R组梗死面积为（18.451.24）%，I/R+rhEPO组梗死面积为（12.321.27）%，I/R+pHBP组梗死面积为（11.642.32）%。与I/R组比较，I/R+rhEPO组和I/R+pHBP组心肌梗死面积均下降，差异均有统计学意义（P0.05）；I/R+rhEPO组与I/R+pHBP组比较，差异无统计学意义（P0.05）。
2.3 各组心肌组织p44/42 MAPK蛋白表达
Western blot 法检测各组p44/42 MAPK蛋白水平，与I/R组比较，制模3 h I/R+pHBP组心肌梗死组织p44/42 MAPK蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（P0.05）；I/R+rhEPO组p44/42 MAPK蛋白表达无明显变化，差异无统计学意义（P0.05）。与I/R组比较，制模24 h I/R+rhEPO组心肌梗死组织p44/42 MAPK蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（P0.05），I/R+pHBP组p44/42 MAPK蛋白表达无明显变化，差异无统计学意义（P0.05）。见表2。
表2 各组p[(www. ) 专业提供论文代写和发表的服务,欢迎光临]44/42 MAPK蛋白表达（ng/L，xs）
注：与假手术组比较，*P0.05；与I/R组比较，#P0.05；I/R：缺血再灌注；rhEPO促红细胞生成素；pHBP：促红细胞生成素类似结构；p44/42 MAPK：蛋白激酶丝氨酸/苏氨酸激酶
3 讨论
心肌细胞凋亡在持续缺血或再灌注期间均可出现，且与缺血程度、缺血时间长短等有关。心肌细胞凋亡在缺血再灌注损伤中所起作用越来越引起人们的重视，但确切机制还不清楚，可能与细胞在受到刺激后产生大量氧自由基、细胞内钙超载、线粒体损伤、炎症细胞浸润和基因调控等有关。
缺血再灌注损伤引起的心肌细胞死亡有两种机制，即坏死和凋亡，并且凋亡是引起心血管系统疾病的重要原因心肌再灌注虽然恢复
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