2018microRNA对人视网膜母细胞瘤肿瘤干细胞多药耐药性的发展效果
视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，RB）是儿童最常见的原发性眼内恶性肿瘤。调查显示5岁以下儿童RB发病率高达11.8/100万，占同龄儿童恶性肿瘤的6.1%。在我国台湾，RB的5年生存率为81%，其中双眼RB 5年生存率仅64.3%。流行病学研究中发现，我国RB诊断滞后，化学减容治疗效果不佳，很多患者最终不得不接受眼球摘除术来控制肿瘤的发展，这主要是由于部分RB表达多种耐药相关蛋白如P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp），多药耐药相关蛋白（multi-drug related protein， MRP）、肺耐药蛋白（lung resistance associated protein，LRP）等，因而对化疗不敏感。恶性肿瘤对化疗的多药耐药性是大多数恶性肿瘤化疗效果不佳最主要的原因。现在越来越多的证据表明，microRNA不但广泛参与各种肿瘤的发生发展与复发转移，而且与肿瘤耐药性的产生有关。这些研究都指出：microRNA与肿瘤干细胞的侵袭性和耐药性密切相关，调控microRNA可以抑制肿瘤干细胞的耐药性，提高其对化疗的敏感性。为探究MicroRNA调控人RB肿瘤干细胞多药耐药性的机制，本研究组做了相关研究，现报道如下：1 材料与方法
1.1 材料与试剂
Y79细胞（由西安交通大学医学院眼科实验室提供），含10%胎牛血清1640培养基、无血清化学限定培养基、10%FBS：1640培养基、抗-ABCG2抗体、IgG2a抗体、山羊抗鼠FITC二抗、MTT试剂盒、Signosis northern blot试剂盒、荧光素酶测试试剂Ⅱ。
实验用抗肿瘤药物为长春新碱、依托泊苷和卡铂。长春新碱浓度梯度为0.1、1.0、10 g/mL，依托泊苷浓度梯度为0、50、100 mol/L，卡铂浓度梯度为0、50、150 mol/L。长春新碱、依托泊苷和卡铂的血浆峰浓度（PPC）分别为5.0、2.0、1.0 g/mL。
1.2 实验方法
1.2.1 Y79细胞的分选及培养（流式细胞术）
用含10%胎牛血清1640培养基培养，扩增Y79细胞至8107个，打碎后重悬至浓度1107个/mL，无菌条件下与抗-ABCG2抗体于4℃孵育20 min，采用IgG2a抗体作为同型对照。PBS洗涤细胞，加入5 L山羊抗鼠FITC二抗，4℃，20 min，3～5次洗涤后上流式细胞仪进行分选。分选后实验组ABCG2（+）细胞用无血清化学限定培养基培养，对照组ABCG2（-）细胞用10%FBS：1640培养基培养，2～3 d换液1次，定期传代。流式细胞法，检测分选后的ABCG2细胞表达率。
1.2.2 化疗药物敏感度实验（real-time PCR检测、MTT比色、引物序列及免疫荧光）
首先委托ABI公设计合成具有茎环（stem loop）结构的反转录引物和用miRNA荧光标记的特异分子探针。用Trizol抽提总RNA，将抽提的RNA进行反转录的cDNAz作为real-time PCR检测的模板，加入引物及探针（表1），调整好总体积后加入96孔板，设3个重复板。将分选出的ABCG2（+）与ABCG2（-）细胞稀释至1105个/mL，接种于96孔板中，每孔105个细胞。加入不同浓度的长春新碱、依托泊苷和卡铂，每种药物分三个浓度梯度（长春新碱浓度梯度为0.1、1.0、10 g/mL，依托泊苷浓度梯度为0、50、100 mol/L，卡铂[(www. ) 专业提供论文代写和发表的服务,欢迎光临]浓度梯度为0、50、150 mol/L）。每种药物分设7个复孔，设置对照组和空白组（以营养液代替试剂），培养2 d。向每孔分别加入20 L MTT，继续培养12 h，将各个孔中的营养液全部吸出，溶解，振荡30 min，选择490 nm 波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值（OD值）。
表1 引物序列、长度及用途
1.2.3 检测细胞凋亡及细胞内药物蓄积实验（流式细胞术）
1.2.3.1 细胞凋亡实验 将分选的ABCG2（+）与ABCG2（-）细胞稀释至1105个/mL，放入培养箱中进行48 h的培养，然后实验组加入卡铂（浓度为1.0 mol/L）；对照组则不加卡铂。培养24 h后，收集待测细胞，并用3000 r/min离心6 min，弃上清液，乙醇固定18 h后离心，PBS洗涤细胞，加入5 L山羊抗鼠FITC二抗，4℃，20 min，3～5次洗涤后上流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.2.3.2 细胞内药物蓄积实验 将分选的ABCG2（+）与ABCG2（-）细胞稀释至1105个/mL，放入培养箱中进行培养24 h，然后加浓度为为1.0 mol/L的卡铂试剂，接着在培养的第4小时和第24小时后，转移至新鲜培养基中继续培养2 h，收集待用细胞于3000 r/min离心机，离心5 min，弃上清液，乙醇固定24 h，PBS洗涤细胞3次，4℃，20 min，3～5次洗涤后上流式细胞仪，在448 nm的激光、679 nm的激光下，测定两组细胞加药后4、24 h内残留的卡铂试剂所释放的荧光强度。
1.2.4 观察候选microRNA在不同耐药性RB切片中的表达（行病理切片、LNA-原位杂交及realtimePCR实验）
病理科切片，行LRP、MRP1，P-gp免疫组化染色，收集高表达三种蛋白的RB标本6例作为高耐药组，均低表达的RB标本6例作为低耐药组；行LNA-原位杂交观察候选microRNA在高耐药组和低耐药组的定位并半定量检测；蜡块组织提取RNA，通过realtimePCR观察候选microRNA在两组中表达差异。
1.3 统计学方法
采用统计学软件SPSS 19.0 进行分析，正态分布计量资料以均数标准差（xs）表示，两组间计量资料采用t检验；计数资料以率表示，采用2检验。以P0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 分选阳性率
流式细胞仪分选Y79细胞中ABCG2（+）及ABCG2（-），分选后ABCG2（+）为91.7%，显著高于分选前（5.7%），差异有统计学意义（P0.05）。见图1。
分选前
分选后
图1 流式细胞仪检测ABCG2在Y79细胞分选前后的表达率
2.2 分选细胞对药物敏感性
MTT法检测ABCG2（+）及ABCG2（-）细胞对长春新碱、依托泊苷和卡铂的耐药性。长春新碱、依托泊苷和卡铂PPC达到0.1 g/mL时，可杀灭和抑制ABCG2（-）细胞；长春新碱、依托泊苷和卡铂PPC达到1.0 g/mL时，ABCG2（+）表现出显著抗药，说明ABCG2（+）细胞在PPC 1.0 g/mL长春新碱、依托泊苷和卡铂的作用下，依然不受其抑制生长；长春新碱、依托泊苷和卡铂PPC达到10.0 g/mL水平以上，对ABCG2（+）细胞才出现抑制作用。对比各个浓度的长春新碱、依托泊苷和卡铂对ABCG2细胞的作用显示，ABCG2（+）细胞有显著高于ABCG2（-）细胞
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