2018HPLC-ELSD法测定血府逐瘀口服液中苦杏仁苷的效果观察
血府逐瘀口服液是一种中药复合制剂,是由十一味中药组成的,包括桃仁、川芎、地黄、红花、牛膝、桔梗、甘草、柴胡、枳壳、当归、赤芍。其主要作用是活血化瘀,行气止痛。可用于治疗瘀血、头痛、胸痛、失眠、瞀闷、心悸等临床症状。近期研究发现,桃仁及其有效成分苦杏仁苷具有同样的药理作用。为了有效地控制该制剂的质量,笔者采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器法(HPLC-ELSD)测定了血府逐瘀口服液中苦杏仁苷的含量。资料与方法
仪器:日本岛津LC-10A高效液相色谱仪,N2100液相色谱工作站,Alltech 2000ES型蒸发光散射检测器。
药品与试剂:血府逐瘀口服液(批号:120101~120110十批次);苦杏仁苷对照品(批号:110820~220403);甲醇为色谱纯;其他试剂都是分析纯;水是超纯水。
方法:①色谱条件与系统适用性试验:Diamonsil C18色谱柱,其规格为250mm4.6mm,5;流动相为甲醇-水(25:75),流速1.0ml/分,其中检测采用蒸发光散射检测器,漂移管温度控制在105℃,空气或氮气作为雾化气体,其流速控制在3.0L/分。在理论上来说,应该按照苦杏仁苷峰值来计算板数,其板数不应该低于3000。②溶液的制备:对照品溶液的制备:对苦杏仁苷对照品进行精密称取适量,将对照品放入棕色瓶中,然后加入甲醇,制造成对照品溶液,其中每1ml对照品溶液中,含0.2mg苦杏仁苷。供试品溶液的制备:取本品0.4g研细,精密称定,置索氏提取器中,加石油醚(60~90℃)适量,加热回流2小时,弃去乙醚液,药渣挥去乙醚,置索氏提取器中,再加甲醇适量,加热回流5小时,提取液浓缩,转移至25ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,得出结果。阴性对照液干扰试验:为进一步考查实验设计过程以及测定样品中苦杏仁苷方法及合理性,取10l的不含苦杏仁苷的阴性对照液,将阴性对照液注入高效液相色谱仪,进行测定,得出结果。测定法:精密吸取5l、15l的对照品溶液,10l的供试品溶液,然后将其注入高效液相色谱仪,进行测定,得出结果,然后用外标二点法对数方程进行计算。③线性关系考察:精密吸取对照品溶液各4l、8l、12l、16l、20l,然后将它们注入色谱仪,按照同样的方法进行测定。采用线性回归进行计算,其中纵坐标为峰面积的自然对数,横坐标为苦杏仁苷进样量的自然对数,回归方程:Y=6.2303+1.2026X。④精密度试验:精密吸取10l供试品溶液,然后注入高效液相色谱仪,连续注入5次,对每次的峰面积进行测量,然后计算RSD值。⑤稳定性试验:精密吸取同一批号的供试品溶液,然后注入高效液相色谱仪,每隔2小时进样一次,按上述的含量测定方法进行测定,对峰面积进行测量,计算RSD值。⑥重现性试验:精密吸取同一批号样品,注入高效液相色谱仪,多次进行测定,计算RSD。⑦回收率试验:采用加样回收法,分别精密取得已知含量的样品和一定量对照品溶液,一共取得6份,将样品加入对照品溶液中,然后进行测定。⑧样品含量测定:采用确定的方法对10个批号的样品进行测定,得出样品含量。
结果
阴性对照液干扰试验结果表明,在苦杏仁苷色谱峰的保留时间处,阴性对照液的色谱图没有出现干扰峰。测定法结果,见表1。
根据以上结果,暂定桃仁药材按干燥品计算,含苦杏仁苷(C20H27NO11)不得1.8%。
线性关系考察:r=0.9995,结果表明,在0.856~4.28g范围内,苦杏仁苷进样量的自然对数与峰面积的自然对数之间,具有较好的线性关系。精密度实验:RSD=0.87%(n=5),结果表明测定仪器的精密度良好。稳定性实验:RSD= 0.92%(n=5)。重现性实验:RSD=1.19%(n=5),结果表明方法重现性良好。回收率试验结果,见表2。
样品含量测定结果,见表3。
讨论
苦杏仁苷的测定方法有3种,分别为滴定法、色谱法及分光光度法。中药复方制剂的成分非常复杂,为了对其中成分的含量进行有效测定,通过使用紫外检测器,采用高效液相色谱法。苦杏仁苷容易在沸水、乙醇中微溶,检测波长为210nm,由于这些理化性质的限制,导致样品中的苦杏仁苷无法分离出来,从而造成供试品中阴性液对照液干扰实验为阳性,得出的结果不准确。而采用蒸发光散射检测器对成分的含量进行检测,供试品中苦杏仁苷色谱峰完全达到基线分离,阴性液对照液干扰实验为阴性,表示无干扰,且其色谱峰有较高的相应信号。本研究结果表明,采用本方法测定苦杏仁苷含量,具有较好重现性、稳定性和精密度,值得推广,该方法一种血府逐瘀口服液的质量控制方法已经取得授权专利。
根据ELSD的原理,样品质量与检测器相应之间是一种指数的关系,而经过对数转换运算,两者之间呈线性关系,具有特定的线性方程式,其截距非零。对含量进行计算是,采用外标二点法对数方程,这样可以减少实验误差。在本研究中就采取了同样的方法,采用线性回归计算,苦杏仁苷进样量的自然对数与峰面积的自然对数之间,具有较好的线性关系;为了得到更加准确的结果,可以在线性范围内,采用对照品溶液二点法校正和含量计算。
参考文献
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