2018益气养阴方对非酒精性脂肪性肝病大鼠胰岛素抵抗的影响
摘要：目的 观察益气养阴方对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）大鼠胰岛素抵抗（IR）的影响，探讨其作用机制。方法 采用饲喂高脂饲料建立大鼠NAFLD模型。实验大鼠随机分为正常组、模型组、阳性药组、益气养阴方组，分别给予蒸馏水、吡格列酮、益气养阴方灌胃，连续8周。进行口服葡萄糖耐量试验（OGTT），HE染色观察肝脏脂肪空泡样改变，放免法检测血清胰岛素含量，GPO-PAP法检测血清三酰甘油（TG）含量。结果 模型组大鼠肝组织出现脂肪堆积导致的空泡样病理损伤，阳性药组、益气养阴方组与模型组比较上述病理损伤明显减轻；OGTT显示口服葡萄糖2 h后，模型组血糖明显高于正常组；与模型组比较，阳性药组、益气养阴方组血糖、血清胰岛素水平和TG含量明显降低（P0.05）。结论 益气养阴方可有效防治NAFLD大鼠IR，其作用机制可能是通过抑制模型大鼠异常升高的TG和胰岛素水平，纠正机体糖脂代谢紊乱，改善其IR。 关键词：益气养阴方；口服葡萄糖耐量试验；三酰甘油；胰岛素抵抗；大鼠 DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.12.012 中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）12-0047-03 Effects of Yiqi Yangyin Formula on Insulin Resistance of Rats with Non-alcoholic Fatty Liver Disease ZHANG Hui-cun1，2， SHANG Ju-ju1， WANG Ning1，2， ZHAI Ya-ting1，2， ZHAO Wei-feng 1，2， LIU Hong-xu1， XIA Jun1 （1.Beijing Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Capital Medical University， Beijing 100010， China；2.Key Laboratory of Beijing Traditional Chinese Medicine Basic Research on Infectious Diseases， Beijing Institute of Traditional Chinese Medicine， Beijing 100010， China） Abstract：Objective To observe the effects of Yiqi Yangyin Formula on insulin resistance （IR） of rats with non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD）. Methods High-fat diet was fed to establish NAFLD rat models. Experimental rats were randomly divided into normal group， model group， positive medicine group， and Yiqi Yangyin Formula group. The groups received distilled water， pioglitazone and Yiqi Yangyin Formula respectively for gavage for 8 weeks. OGTT was conducted；HE dyeing was used to detect the fat spongiform in liver；Radioimmunoassay was used to detect insulin content in serum；GPO-PAP was used to detect TG content in serum. Results HE dyeing results showed that vacuolar pathological injury caused by fat accumulation in liver tissue occurred in the liver of rats in the model group， while pathology injury decreased significantly in positive medicine group and Yiqi Yangyin Formula group. OGTT results showed that after 2 h of oral administration， the blood glucose in the model group was greatly higher than the normal group. Compared with the model group， the blood glucose insulin level and TG content in serum decreased significantly in the positive medicine group and Yiqi Yangyin Formula group （P0.05）. Conclusion Yiqi Yangyin Formula can effectively prevent and treat IR of rats with NAFLD. Its mechanism may be achieved through decreasing the abnormal insulin and TG， regulating glucose metabolism disorder. Key words：Yiqi Yangyin Formula；oral glucose tolerance test；TG；insulin resistance；rats基金项目：国家中医药管理局中医药重点学科（2010年） 非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指患者肝内脂肪储量5%，并且排除乙醇、病毒、自身免疫等损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，是与胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤。IR被认为是三酰甘油（TG）在肝细胞沉积的重要因素。一方面IR时脂肪分解加强，造成肝细胞内游离脂肪酸蓄积；另一方面IR高胰岛素血症可造成肝脏TG输出减少进而导致肝脏脂肪堆积。IR与肝细胞脂肪变性相互促进，形成病理性正反馈，IR是NAFLD发病的始动及中心环节。本实验采用高脂饲料诱导的大鼠NAFLD模型，进行口服葡萄糖耐量试验（OGTT），观察益气养阴方对NAFLD大鼠IR及血脂的影响，为其临床治疗肝源性代谢性失调疾病提供实验依据。 1 实验材料 1.1 药物 益气养阴方由西洋参、黄芪、麦冬、石斛等中药组成，所有饮片购自首都医科大学附属北京中医医院门诊药房，按实验动物与人体体表面积比等效量核算比率，计算动物的等效剂量，制作成浸膏；吡格列酮片，天津武田药品有限公司，批号155A。 1.2 动物和饲料 SPF级SD雄性大鼠28只，4周龄，体质量（12020）g，北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2009-0012。饲养于北京市中医研究所清洁级动物房，12 h光照和黑暗循环，温度（222）℃，湿度50%～60%。高脂饲料（88%基础饲料+10%猪油+2%胆固醇）由北京科澳协力饲料有限公司加工制作。 1.3 主要试剂与仪器 TG试剂盒（GPO-PAP），中生北控生物科技股份有限公司；胰岛素放免试剂盒（HY-10069），北京华英生物技术研究所。7160全自动生化仪（日立），r-911全自动放免计数仪（中国科技大学实业总公司），BX51光学显微镜（OLYMPUS），优越型血糖仪（德国罗氏）。 2 实验方法 2.1 分组、造模和给药 实验大鼠予普通饲料适应性饲喂1周后，按随机表法分为正常组、模型组、阳性药组、益气养阴方组，每组7只。正常组饲喂普通饲料，其余3组饲喂高脂饲料，连续8周，建立NAFLD模型。益气养阴方组、阳性药组在饲喂高脂饲料的同时，分别给予益气养阴方水煎液（4.5 g/kg）和吡格列酮混悬液（4 mg/kg）灌胃，均相当于临床成人日用量的7倍；模型组和正常组给予等量生理盐水灌胃。给药体积均为10 mL/kg，每日1次，连续8周。 2.2 口服葡萄糖耐量试验 实验结束，各组大鼠禁食12～14 h后，剪尾采血测定空腹血糖（FBG），然后以2 g/kg葡萄糖灌胃，于60、120 min自大鼠尾静脉取血，快速血糖仪检测血糖。 2.3 取材 给药8周后，大鼠腹腔注射1.5%戊巴比妥钠溶液2.5 mL/kg麻醉，将大鼠固定，腹主动脉取血，取肝脏冷生理盐水清洗后，置于-80 ℃冰箱冻存备用。 2.4 肝组织病理观察 取肝，固定，包埋，石蜡切片脱蜡至水，苏木精染色20 min，伊红染色10 min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察，并连续拍照。 2.5 大鼠血清胰岛素测定 取样本和标准品（S1～S5）各100 L，胰岛素抗体100 L，I125标记胰岛素100 L，在聚乙烯试管中4 ℃混匀，反应24 h，加分离剂500 L，4 ℃、3500 r/min离心15 min，去上清液，应用r-911全自动放免计数仪自动检测沉淀的放射性计数值。 2.6 三酰甘油和胰岛素抵抗指数测定 GPO-PAP法检测血清TG。比色法检测FBG，采用稳态模式评估法（HOMA）计算IR指数。HOMA-IR=FBG空腹胰岛素22.5。 3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以xs表示，组间比较采用方差分析。P0.05表示差异有统计学意义。 4 结果 4.1 一般情况 正常组大鼠毛色洁白、富有光泽，行动敏捷，饮食及排泄物无异常，体质量逐渐增加。模型组大鼠毛色枯黄，色泽黯淡，喜团聚蜷卧，饮食量较正常组减少，大便干稀不调。各治疗组大鼠毛色、行为、饮食及排泄物与正常组比较均无明显异常，个别大鼠可见大便稀软。 4.2 益气养阴方对大鼠口服葡萄糖耐量试验的影响 与正常组比较，60、120 min模型组大鼠血糖升高；与模型组比较，60、120 min阳性药组和益气养阴方组血糖降低（P0.05）。结果见表1。 4.3 益气养阴方对大鼠胰岛素抵抗指数、三酰甘油含量和胰岛素水平的影响 与正常组比较，模型组大鼠血清HOMA-IR、TG含量和胰岛素水平明显升高（P0.05）；与模型组比较，阳性药组、益气养阴方组HOMA-IR、TG含量和胰岛素水平明显降低（P0.05）。结果见表2。 表1 各组大鼠OGTT结果比较（xs，mmol/L） 注：与正常组同一时点比较，#P0.05；与模型组同一时点比较，*P0.05 表2 各组大鼠血清HOMA-IR、TG含量和胰岛素水平比较（xs） 注：与正常组比较，#P0.05；与模型组比较，*P0.05 4.4 病理观察结果 正常组大鼠肝小叶形态结构正常，肝细胞排列整齐，未见明显脂滴空泡形成；模型组大鼠肝组织出现脂肪变性，表现为肝细胞肿胀呈圆形，体积较正常组明显增加，胞质内可见大量脂肪空泡及气球样变；益气养阴方组、阳性药组大鼠肝组织脂肪空泡、气球样变均有所改善。结果见图1。 正常组 模型组 阳性药组 益气养阴方组 图1 各组大鼠肝组织形态比较（HE染色，100） 5 讨论 关于NAFLD发病机制，二次打击学说已被较为广泛接受。IR导致肝内脂质蓄积是NAFLD发生、发展过程中的第一次打击，也是近年来学术界研究热点之一。一般认为，高脂饮食可引起肝脏脂肪变性，大量脂质在肝细胞内沉积，是NAFLD形成和发展的先决条件，NAFLD患者多伴有超重/肥胖、糖耐量减退、2型糖尿病等IR相关疾病，NAFLD是IR在肝脏中的表现形式，是代谢综合征组成成分。 肝脏脂肪代谢与许多调节能量代谢维持组织完整性的代谢产物、激素、细胞因子和神经介质的作用相关。IR是脂肪肝发生发展的基础，随着肝脏疾病的慢性进展，肝细胞反复受损伤，糖代谢异常及IR发生率逐渐增高，常伴有高血糖和高胰岛素血症，这与本实验结果相符合。本实验结果显示，模型组大鼠血清胰岛素含量显著高于正常组，各治疗组均可降低模型大鼠血清胰岛素含量，但组间差异无统计学意义。 肝细胞脂肪变性可促进胰岛素分泌，肝细胞TG沉积本身可导致胰岛素与胰岛素受体结合减少，从而导致IR，形成IR与脂肪肝之间的恶性循环。本实验结果表明，益气养阴方还可降低大鼠血清TG含量，纠正肝细胞脂肪沉积，进而可能促进胰岛素与胰岛素受体结合，改善IR。陈氏探讨不同糖代谢状态与NAFLD相关性，结果显示，随着糖耐量受损的加重，NAFLD患病增加。而本实验OGTT检测结果表明，益气养阴方可改善NAFLD大鼠IR所致的糖耐量降低，从而改善NAFLD大鼠IR。有研究表明，黄芪、党参可明显改善糖尿病合并NAFLD大鼠的糖代谢状态，改善大鼠IR，对糖尿病合并NAFLD有较好的治疗作用，与本实验结果相符。 综上所述，由于益气养阴方与吡格列酮均可显著降低模型大鼠血清TG和胰岛素含量，并改善糖耐量异常，进而有效改善NAFLD大鼠IR。吡格列酮属噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂，其改善IR机制主要为：通过活化过氧化物酶增殖体激活受体，提高机体胰岛素敏感性，加强胰岛素信号的传导、提高外周组织对葡萄糖的转运、改善胰岛细胞功能达到消除IR和降低血糖及调控血脂的作用。故我们推测益气养阴方可能作用于上述环节，从而改善NAFLD大鼠IR。 参考文献： Angulo P. 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