2018高原低氧环境气虚小鼠心、肺反应性变化的分子机制研究
摘要：目的 探讨高原低氧环境气虚小鼠心、肺反应性变化的分子机制。方法 SPF级模型组小鼠置于低氧舱内进行减压低氧暴露，对照组在常氧环境中饲养，连续21 d。观察小鼠体征。末次低氧暴露后检测2组小鼠心乳酸脱氢酶（LDH）、Na+-K+-ATP酶活性，肺功能变化，心、肺组织缺氧诱导因子-1（HIF-1）及肺组织通道蛋白-5（AQP5）蛋白和基因表达。结果 模型组小鼠出现气虚体征。与对照组比较，模型组小鼠心LDH活性增高、Na+-K+-ATP酶活性降低（P0.05，P0.01）；肺功能指标检测结果显示，模型组小鼠吸气时间、呼气时间、持续时间、潮气量、呼气末端停顿均降低和频率升高（P0.05，P0.01）；心、肺HIF-1蛋白、基因表达均增高，肺AQP-5基因表达增高（P0.05，P0.01）。结论 较长时间的高原低氧暴露，可导致小鼠表现气虚体征并出现肺通气效率降低。心肌受损可能与心Na+-K+-ATP酶活性变化有关，而心、肺HIF-1表达及肺AQP-5基因表达升高，可能有利于提高心、肺的适应性代偿反应。 关键词：高原低氧暴露；气虚；乳酸脱氢酶；钠-钾-ATP酶；缺氧诱导因子-1；水通道蛋白-5；小鼠 DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.12.013 中图分类号：R223；R228 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）12-0050-05 Study on Molecular Mechanism of Reactive Changes in Heart and Lung of Mice in High Altitude Hypoxia LUO Ya-li1，2， LIU Yong-qi1，2， AN Fang-yu3， SUN Li-jiao4， CAI Lu-lu4， LI Xin4， MA Yan-ping4 （1.Key Laboratory for Molecular Medicine of Major Diseases and Prevention and Treatment with Traditional Chinese Medicine Research at Provincial Level， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China；2.Key Laboratory of Dunhuang Medicine and Transformation at Provincial and Ministerial Level， Lanzhou 730000， China；3.Experimental Teaching Center， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China；4.College of Public Health， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China） Abstract：Objective To discuss the molecular mechanism of reactive changes in heart and lung of mice models in high altitude hypoxia environment. Methods Healthy SPF mice were put in hypoxia cabin for decompression and hypoxia exposure to make model， and mice in the control group were fed in normoxia environment for 21 days. The physical signs of the mice were observed. After the last time of hypoxia exposure， mice were detected for indexes of correlation along with the control group. LDH， Na+-K+-ATPase activities of heart， changes of pulmonary function， and gene and protein expression of HIF-1 in the heart and lung tissue， AQP-5 in the lung tissue were detected. Results Mice in the model group showed signs of qi deficiency. Compared with the control group， Na+-K+-ATPase activity of heart tissue was lowered （P0.01） but LDH was raised significantly （P0.05） in the model group. The detection results of pulmonary function displayed that the indexes such as Ti， Te， RT， EEP and TV were all dropped （P0.05 or P0.01） in the model group. However， the respiratory frequency increased significantly. The gene and protein expressions of HIF-1 in heart and lung all increased （P0.05 or P0.01） in the model group. 基金项目：甘肃省科技支撑计划（1204FKCA169）；国家科技支撑计划（2011BAI05B02）；敦煌医学与转化省部共建教育部重点实验室开放基金（DHYX1213-012） 通讯作者：刘永琦，E-mail：liuyongqi73@163.com Also the gene expression of AQP-5 in lung increased obviously （P0.01）. Conclusion Long time exposure in high altitude hypoxia environment can cause qi deficiency and low pulmonary ventilation. Impaired myocardium may be related to the changes of Na+-K+-ATPase activity. The increase of expressions of HIF-1 in heart and lung and AQP-5 in lung may be beneficial to adaptive compensatory reaction of heart and lung. Key words：high altitude hypoxia exposure；qi deficiency；LDH；Na+-K+-ATPase；HIF-1；AQP-5；mice 高原反应发病急、病程短、危险性大。高海拔地区的低气压、低氧、低温、强辐射等作为重要的生态因子，严重影响着生物的生存与发展。高海拔缺氧环境相关疾病的研究越来越受到学者关注。其中，低氧作为主要影响因素可对人体心、肺组织产生较大影响，使其功能及代谢水平等发生相应变化。在高原环境，人体容易发生高原气虚证。目前，对于高原病发病的分子机制已有一定的认识，但关于高原低氧环境下肺功能及肺缺氧诱导因子-1（HIF-1）表达检测的相关报道较少，且对肺组织水通道蛋白-5（AQP-5）功能研究尚存在争议。本研究利用低压低氧舱建立高原低氧气虚小鼠模型，通过观察肺功能改变及心乳酸脱氢酶（LDH）、Na+-K+-ATP酶活性，以及肺AQP、HIF-1表达，探讨心、肺组织发生反应性变化的分子机制。 1 实验材料 1.1 动物 SPF级6～8周龄KM种小鼠，体质量18～22 g，甘肃中医药大学科研实验中心SPF级实验室提供并饲养，动物合格证号SCXK（甘）2011-0001。 1.2 主要试剂与仪器 Trziol Reagent试剂（美国Invitrogen公司），考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒、LDH检测试剂盒、超微量Na+-K+-ATP酶检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），RNA酶（上海远慕生物科技有限公司）， GoScriptTM Reverse Transcription System试剂盒、GoTaq qPCR Master Mix试剂盒（promega），标准品小鼠-actin、目的基因HIF-1、AQP-5 PCR引物，山羊抗兔多克隆抗体（ABCAM公司），山羊抗小鼠HIF-1抗体（IMMNUWAY公司），TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司公司设计并合成。Molecular Imager ChemiDocTM XRS+With Image LabTM Software（BIO-RAD），肺功能测定仪（美国EMKA TECNOLOGY公司），Bcnchnark Plus连续波长酶标仪（上海闪谱生物科技有限公司公司）， 7500实时PCR System（上海英潍捷基贸易有限公司），低压氧舱FLYDWC 50-IIA（贵州风雷航空军械有限责任公司）。 2 实验方法 2.1 高原低氧气虚小鼠模型的建立 小鼠适应性饲养1周，常规饮食，自由饮水。随机数字表法将小鼠分为对照组和模型组各15只。参照文献方法建立高原低氧气虚小鼠模型，模型组小鼠置低压氧舱内进行减压低氧暴露：以10 m/s速度上升至3000 m 停留5 min，以同样速度上升至4500 m停留3 min，再以10 m/s 速度上升至6000 m，低氧暴露22 h后，以15 m/s速度降至海平面高度，每日1次。对照组小鼠在常氧环境中饲养。连续21 d，末次低氧暴露后与对照组小鼠一起测定相关指标。股动脉放血处死小鼠，打开胸腔取出心、肺组织。实验过程中模型组死亡2只，对照组无死亡。 2.2 指标检测 2.2.1 小鼠气虚体征观察 分别于实验第7、14、21日观察小鼠皮毛、皮肤色泽、爪甲颜色及精神状况。 2.2.2 肺功能检测 小鼠出舱后，参照文献方法进行肺功能检测。运行IOX数据采集系统软件，调试设备。开启小鼠呼吸机、信号调理器，建立新实验，启动数据采集。将小鼠分批放入体积描记箱中，无创清醒状态下进行肺功能测试。 2.2.3 心肌组织乳酸脱氢酶、Na+-K+-ATP酶活性检测 准确称取心肌组织质量，按1∶9比例加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，2500 r/min离心10 min，取上清液，用生理盐水按1∶4稀释成2%组织匀浆备用。2，4-二硝基苯肼比色法测定心LDH活性；无机磷比色法测定心Na+-K+-ATP酶活性。具体操作方法严格按照试剂盒说明进行。 2.2.4 心肌组织缺氧诱导因子-1表达检测 Western blot检测心肌组织HIF-1蛋白表达。提取心肌组织总蛋白，用牛血清白蛋白制作标准曲线，检测蛋白含量。制胶，样品变性，上样，电泳，转膜。将封闭后的膜依次放入稀释的一抗（1∶500），摇动孵育1 h，4 ℃孵育过夜。洗膜，将其置于用5%牛奶封闭液配置山羊抗兔辣根酶标记的二抗（1∶5000）中室温状态摇床孵育2 h。TBST 漂洗。显影，用保鲜膜覆盖后由Bio-Rad凝胶成像仪采集信号并摄取凝胶图像。用Quantity One软件计算各条带的光密度值，同时以GAPDH作为内参照，将目的蛋白灰度值与内参灰度值相比得出目的蛋白相对表达量。 实时荧光定量PCR检测心肌组织HIF-1基因表达。称取100 mg心肌组织，Trizol提取组织总RNA。制胶，上样，RNA琼脂糖凝胶电泳。按照promega试剂盒说明合成cDNA。结束后取合成产物进一步进行实时荧光定量检测。PCR反应管中依次加入试剂，并混匀25 ?L体系。上机检测，条件如下：预变性95 ℃、2 min，变性95 ℃、15 s，退火58 ℃、45 s，延伸60 ℃、1 min。45个循环，PCR完成后进行融解曲线和扩增曲线分析，利用系统软件计算各样本Ct值，并用Relative Expression Software Tool（REST version 2009）软件分析数据，进行组间比较。引物与目的基因序列：-actin-F：5'-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3'； -actin-R：5'-ATGGAGCCACCGATCCACA-3'，扩增产物长度171 bp；HIF-1-F：5'-GGACGATGAACATCAAGCA-3'；HIF-1-R：5'-AGGAAT GGGTTCACAAATCAGCA-3'，扩增产物长度146 bp；AQP-5-F：5'-GGTCACACTGGGGCCATC TTG-3'；AQP-5-R：5'-AAAGATCGG GCTGGGTTCA-3'，扩增产物长度166 bp。 2.2.5 肺组织缺氧诱导因子-1、水通道蛋白-5表达检测 Western blot检测肺组织HIF-1蛋白表达及实时荧光定量PCR检测肺组织HIF-1、AQP-5基因表达，检测方法和目的基因序列同2.2.4项。 3 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据以xs表示，组间均数比较采用t检验。P0.05表示差异有统计学意义。 4 实验结果 4.1 气虚体征观察结果 4.1.1 皮肤色泽、爪甲颜色观察 各时间点观察对照组小鼠均表现为被毛光泽，耳朵、尾巴、爪甲色泽红润光泽。实验第7日，模型组42.86%（6/14）小鼠出现被毛黯淡枯燥，缺乏光泽。实验第14日，模型组78.57%（11/14）小鼠被毛黯淡无光泽、蓬松，口唇、耳廓紫绀，尾巴、爪甲色泽黯红。实验第21日，模型组小鼠全部（13/13）出现被毛黯淡无光泽、蓬松，爪甲色泽黯红，口唇、耳廓、尾尖至尾根均出现紫绀。 4.1.2 精神状态观察 各时间点观察对照组小鼠均动作迅速，目光明亮有神，反应灵敏，活泼好动。实验第7日，模型组57.14%（8/14）小鼠饮食、饮水减少，喜卧；实验第14日，模型组71.43%（10/14）小鼠饮食、饮水减少，精神差，目光无神，呆滞、少动；实验第21日，全部模型组小鼠（13/13）饮食、饮水减少，无精打采，眼睛紧闭或微睁，自主活动少，对外界刺激反应迟钝，活动明显减少。 4.2 肺功能检测结果 与对照组比较，模型组小鼠吸气时间（Ti）、呼气时间（Te）、呼气末端停顿（EEP）、持续时间（RT）、潮气量（TV）均降低且频率（f）升高（P0.05，P0.01）。而比较吸气气流高峰流速（PIF）、呼气气流高峰流速（PEF）、最大呼气量（EV）、吸气末端停顿（EIP）、呼吸停顿（Penh）、呼出50%气量时流速（EF50）等指标均无明显差异（P0.05），见表1、表2。 表1 2组小鼠肺功能通气时间指标比较（xs） 注：与对照组比较，*P0.05，**P0.01（下同） 表2 2组小鼠肺功能通气量、通气流速比较（xs） 4.3 高原低氧对小鼠心肌组织乳酸脱氢酶、Na+-K+-ATP酶活性的影响 与对照组比较，模型组小鼠心肌组织LDH酶活性增高、Na+-K+-ATP酶活性降低（P0.05，P0.01），见表3。 4.4 高原低氧对小鼠心、肺组织缺氧诱导因子-1蛋白表达的影响 与对照组比较，模型组心、肺组织HIF-1蛋白表达增高（P0.05，P0.01），见图1。 4.5 高原低氧对小鼠心、肺组织缺氧诱导因子-1及肺组织水通道蛋白-5基因表达的影响 各提取RNA产物琼脂糖凝胶电泳结果显示，呈现3条大小不同清晰条带，依次为28、18、5.8 s，见图2。与对照组比较，模型组心肌组织HIF-1基因表达及肺组织HIF-1、AQP-5基因表达均明显增高（P0.05，P0.01），见表4。 表3 2组小鼠心肌组织LDH、Na+-K+-ATP酶活性比较（xs，U/L） 对照组 模型组 心HIF-1 GAPDH 93 kD 36 kD 对照组 模型组 肺HIF-1 GAPDH 93 kD 36 kD 图1 2组小鼠心、肺组织HIF-1蛋白表达 28 s 18 s 5.8 s 图2 总RNA琼脂糖凝胶电泳 表4 2组心、肺组织HIF-1及肺组织AQP-5基因表达比较（2-Ct） 5 讨论 高原气虚证主要是由于环境中氧气不足和寒冷所致，平原气虚证主要是由于久病、身体虚弱所致。二者致病原因和疾病特点不同，因此建立符合高原气虚证病因病机的疾病模型从而开展相关研究很有必要。本实验采用长期低氧暴露模拟高原地区的主要气候特点和气虚的病因病机，建立高原气虚证小鼠疾病模型。气虚证动物模型的外观表征包括活动状态及皮毛、眼、爪甲、耳、鼻、唇等的色泽。小鼠被毛无光泽、爪甲色淡较黯红，皮肤黏膜紫绀皆是由于气虚证机体失养所致。随着低氧暴露时间延长，小鼠喜卧、活动减少，运动能力降低均属于疲劳状态的反映。阳气者，人之神，本实验模型组小鼠精神状态差反映了气虚神疲。肺最主要的功能是外呼吸，肺功能是机体气道功能的最客观准确的指标。高海拔环境具有低压缺氧、气候干燥、寒冷等特点，这些均对肺功能产生较大影响，其生理结构和功能均会发生相应的变化。赵氏等报道，南极不同海拔下考察队员中部分出现呼吸困难、呼吸频率加快的表现。本实验结果显示，与对照组比较，模型组呼吸频率显著升高，与文献报道一致。一般情况下，初到高原者低氧刺激外周化学感受器反射地引起呼吸加深加快，增加通气量，这是呼吸功能产生的代偿性反应。但久居高原者或在高原适应较长时间后，肺通气量增加并不显著。但何氏等实验发现，高海拔组的肺活量等指标反而出现低于平原组的情况，认为可能机体在低氧环境使通气反应迟钝，呼吸驱动不足。同时，高海拔缺氧还使肺血管反应性增加，导致肺血管缺氧性收缩，尤以小气道黏膜血管收缩最为明显，引起气体交换发生障碍，随着海拔的增高，空气稀薄的加重，使气道阻力增大，从而出现通气功能障碍。也有研究报道，若呼吸功能以频率调节为主，而潮气量减小，呼吸做功增加但通气效率降低，是缺氧耐力不佳的象征。本实验结果显示，模型组潮气量降低，每分钟通气量无显著变化，考虑可能是模拟高原缺氧时间较长，超出肺的适应性代偿能力，导致肺功能下降。本实验结果显示，小鼠呼气气流高峰流速未见明显变化，与文献报道一致。而吸气时间、呼气时间、持续时间、呼气末端停顿等指标均降低未见文献报道，可能与呼吸频率加快有关。 心脏是人体内对缺氧较为敏感的器官，容易因严重缺氧缺血造成心肌损伤。心肌缺血缺氧损伤时，由于细胞内Ca2+超载可激活磷脂酶A，导致膜磷脂的分解，由黄嘌呤氧化酶途径生成的自由基增加可造成膜脂质的过氧化，这些变化均可引起细胞膜的破坏，导致细胞死亡。LDH是与组织细胞能量代谢过程密切相关的酶，其活性大小可以在一定程度上反映动物机体是否缺氧及缺氧程度，当细胞内氧分压较低时，LDH活性升高，通过加速糖酵解过程为组织细胞提供能量。Na+-K+-ATP酶是参与主动运转的离子泵的重要成分，在维持细胞内外离子交换的过程中具有重要作用，它们可作为代谢紊乱及组织损伤恢复能力的可靠指标。本实验结果表明，高原缺氧导致心肌组织LDH酶活性升高可能促使细胞加强糖酵解。同时心肌组织Na+-K+-ATP酶活性显著下降导致机体代谢障碍，加重心肌组织的损伤。 目前，HIF-1在高原低氧适应性的研究中备受关注，广泛表达于脑、心、肺等组织器官。现已明确，HIF-1以异源二聚体的形式存在于细胞内，其中氧调节亚基HIF-1是影响该因子表达水平、蛋白质稳定性，促转录活性的主要因素。在氧浓度正常时，细胞内表达量通常维持在较低水平，且易于泛醌化而被蛋白酶水解；当在低氧环境时，转录和翻译水平则呈指数增加。当组织器官出现缺血缺氧表现时，细胞内普遍出现HIF-1的聚集，加强糖酵解反应，为细胞提供能量，促进血管生成和红细胞携带氧气的能力。HIF-1能调控下游多种靶基因表达，改善心肌缺血，减少损伤，在肺动脉高压等方面有重要意义。HIF-1 mRNA在高原土著动物的多种组织中均有表达，且表现出明显的组织差异性。高原土著动物HIF-1 mRNA在各组织中的表达量普遍增高，可能是高原土著动物适应高原低氧环境的分子基础。Liu Zhong等研究显示，肺组织HIF-1 mRNA表达的增高有利于减轻高原肺水肿。本实验结果表明，高原缺氧导致心、肺HIF-1的蛋白及基因表达均增高，有利于HIF-1蛋白在细胞核内快速累积，进而迅速诱导参与氧代谢的低氧反应性基因的活化，从而提高机体对氧摄取、转运、组织弥散和利用，可能由此减弱低氧对心、肺重要脏器的损伤。本课题组前期研究表明，免疫炎性因子平衡对肺组织损伤发挥重要作用。同时有研究显示，急性低氧促进海马白细胞介素（IL）-6和HIF-1的表达增强。本研究结果中HIF-1表达变化是否与调控炎症因子有关，有待进一步研究。 Kaur等研究发现，缺氧除影响HIF-1的表达外，也影响AQP的表达。AQP-5位于Ⅰ型肺泡上皮细胞，有报道称其与肺水肿的形成有关，主要作用是清除肺泡内的水，其表达量减少是Ⅰ型肺泡上皮细胞损伤的特异性指标。研究发现，AQP-5可促进渗透压改变导致水的快速转运。AQP表达下降或功能改变可能削弱机体在肺损伤时对肺组织中多余液体的消除能力，从而加重肺间质和肺泡水肿。所以，AQP-5的异常表达到底是导致损伤后水肿形成还是水肿形成后机体反应性诱导其异常表达仍留有分歧。本实验结果表明，高原缺氧导致肺组织AQP-5的表达增多，我们认为AQP-5可能促使肺间质和肺泡中液体清除，从而对肺水肿的发生起代偿作用。研究发现，在鼻息肉组织中，AQP-5与HIF-1蛋白表达水平上呈明显正相关。本实验结果显示，高原缺氧小鼠肺HIF-1和AQP-5的表达均增多，提示可能HIF-1减轻高原肺水肿的机制与其调控AQP-5表达有关。 参考文献： 张早华，杨金洪.外环境低氧损伤证候特点及气虚证新知识探索.中国中医药信息杂志，2008，15（12）：8-10. 安方玉，刘永琦，骆亚莉，等.当归不同有效部位对高原低氧模型小鼠免疫功能的影响.中国中医药信息杂志，2015，22（2）：51-54. 蔺兴遥，张毅，李娟，等.黄芪黄酮与红芪黄酮对肺间质纤维化模型大鼠肺功能影响的对比研究.中成药，2013，35（8）：1770-1773. 黄丽，雷磊.气虚血瘀证动物模型研究应用现状.中医药导报，2007， 13（11）：81-82. 赵顺云，朱海宏，郭亚民，等.南极不同海拔下考察队员心肺功能相关指标变化的研究.高原医学杂志，2012，22（3）：11-13. 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