2018非综合征型感音神经性聋患儿GJB2基因突变分析
【摘要】 目的：对非综合征型感音神经性聋患儿的耳聋基因突变进行具体分析，研究GJB2基因突变与相应的特异性临床表现，为耳聋患者的遗传咨询、产前诊断以及临床治疗提供理论基础。方法：收集深圳地区遗传性非综合征耳聋患者100例和健康对照组50例，应用聚合酶链反应和直接测序法，检测GJB2基因的突变情况。结果：通过基因对照，发现100例耳聋患者中共检出携带GJB2 235delC点突变56例，占56%。其中，26例为纯合性突变，30例为杂合性突变。结论：GJB2基因突变是非综合征型感音神经性聋人群重要的分子病因之一，GJB2基因最为常见的突变类型是235delC，对GJB2基因进行临床检测具有重大意义。 【关键词】 耳聋； GJB2基因； 基因突变； PCR扩增； 限制性内切酶酶切分析 【Abstract】 Objective：To analyze GJB2 gene mutations in patients with non-syndrome children with neurosensory deafness，and ravel specific clinical manifestations of deafness gene and corresponding and provide a theoretical basis for genetic counseling，prenatal diagnosis and clinical treatment.Method：GJB2 gene was detected by polymerase chain reaction and direct sequencing of 50 patients with hereditary non syndrome deafness in Shenzhen and 100 healthy controls.Result：The 100 patients with 235delC GJB2 point mutations were detected by polymerase chain reaction and direct sequencing in 56 patients.Among them，26 cases were homozygous mutation，and 30 cases were heterozygous mutation.Conclusion：GJB2 gene mutation is one of the most important molecular causes of non syndrome children with nervous deafness，and the most common mutation type of GJB2 gene is 235delC，and itis of great significance for clinical detection of GJB2 gene. 【Key words】 Deafness； GJB2 gene； Gene mutation； PCR amplification； Restriction enzyme digestion analysis First-authors address：The Third Peoples Hospital of Shenzhen，Shenzhen 518112，China doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.21.006 由于家族遗传和多种生存因素的影响，感音神经性耳聋成为高发率疾病之一，根据产生原因可分为遗传性耳聋与非遗传性耳聋。通过研究发现，作为常见的遗传性疾病之一，遗传性耳聋主要由多种相应的基因突变导致。遗传性耳聋又细分为综合征耳聋（syndromic hearing loss， SHI）和非综合征耳聋（non-syndromic hearing loss，NSHL），其中，经过多年临床研究发现，NSHL主要通过常染色体隐性遗传，占79%，由GJB2（gap junction beta2）基因突变所导致的重度及极重度语前聋占其中的51%。笔者通过对非综合征型感音神经性聋患儿的耳聋基因突变进行具体分析，研究GJB2基因突变与相应的特异性临床表现，从而为耳聋患者的遗传咨询和产前诊断提供理论基础，现报道如下。 1 资料与方法 1.1 一般资料 收集深圳地区遗传性非综合征耳聋患者100例和健康对照组50例，提取DNA，利用PCR扩增及限制性内切酶酶切分析初筛GJB2 235delC突变者，然后再进行DNA直接测序。 1.2 方法 1.2.1 DNA制备 使用试剂盒提取DNA，根据试剂盒中的说明书步骤进行DNA提取，利用紫外分光光度计对提取的适量DNA进行定量和纯度检测，余量放-60 ℃冰箱保存备用。 1.2.2 引物设计与合成 可以通过上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物。A片段中的正向引物序列为Cx26AF：5-TCTTTTCCAGAGCAAACCGCC-3，反向引物序列为Cx26AR：5-GCCTTCGATGCGGACCTTC-3；B片段中的正向引物序列为Cx26BF：5-CCGGAGACATGAGAAGAAGAG-3，反向引物序列为Cx26BR：5-TGAGCACGGGTTGCCTCATC-3。 1.2.3 235delC 酶切检测 通过PCR反应进行DNA编码区的扩增。PCR产物20L加入限制性内切酶ApaI（MBI公司）2.5L，相应的缓冲液3L加双重蒸馏水至总体积30L。2%琼脂糖凝胶电泳。正常PCR产物中有ApaI酶切位点GGGCCC，可被酶切为155 bp和267 bp两条带；如有235delC突变，酶切位点就会消失；如为纯合突变，其PCR产物不被酶切，仅有一条442 bp的条带；如为杂合突变，则其中一条DNA链被酶切为155 bp和267 bp两条带，另一条DNA链不被消化，即会出现三条带：422 bp、155 bp和267 bp。 1.2.4 DNA测序 对酶切反应的PCR产物进行纯化处理，再作Cycle Sequencing反应。反应过程中的实验条件为95 ℃1 min，95 ℃变性10 s，5 ℃退火5 s，60 ℃延伸4 min，循环25次。对反应产物进行醋酸钠/酒精纯化，用ABI377测序仪进行直接测序（正反向测序），通过DNAstar软件的SeqMan分析测序结果。 2 结果 2.1 临床资料分析 对100例耳聋患者进行纯音测听检查、听性脑干反应检查。听性脑干反应检查结果与纯音测听检查结果相符，见表1。 2.2 酶切结果 对100例感音神经性耳聋患儿和对照组样本进行酶切反应，观察并查出GJB2 235delC位点突变。对酶切产物进行电泳处理后发现：100例耳聋患者中三条条带（853 bp、467 bp和300 bp）者3例，说明存在GJB2 235delC杂合突变；一条条带（300 bp）者2例，说明GJB2 235delC纯合突变，其余为两条条带（155 bp和267 bp），说明无235delC 突变，见图1。 2.3 测序结果 通过对酶切结果呈阳性样本的PCR产物进行DNA直接测序，共检出携带GJB2 235delC点突变56例，占56%。其中，26例为纯合突变，30例为杂合突变，与酶切结果差异较小，见图2。 3 讨论 GJB2基因全长为4804 bp，编码区为678 bp，主要由两外显子组成，即一个外显子1（exon1）和一个长蛋白编码外显子2（exon2），且编码区主要存在于外显子2上。GJB2基因编码产物为缝隙连接蛋白Connexin-26（Cx26），Cx26为跨膜蛋白，含5类结构域：N端结构域，2个细胞外结构域，4个跨膜结构域，C端结构域和胞质连接结构域。Cx26蛋白在细胞缝隙连接处以六聚体的形式形成穿膜通道，分布于耳蜗的血管纹、基底细胞、螺旋缘凸、神经感觉上皮及耳蜗传导纤维等处，是细胞间电解质、第二信使和代谢物质的重要通道，在信息传递和物质交换中发挥重要作用。 非综合征性感音神经性耳聋主要由于GJB2基因突变引起，目前，经过临床研究，在GJB2基因中已发现111中突变形式，显性突变9种，隐性突变92种。由于不同突变形式导致病变产生得原因有多种：由于起始密码子的突变，即1AG，将GJB2基因的起始密码从Met变成Val，但是这种突变方式不合成蛋白质；碱基插入或缺失，如35delG，269insT，使GJB2基因发生移码突变，Cx26蛋白的氨基酸序列发生变化，导致Cx26失活；基因突变后出现终止密码子，如132GA，导致突变后Trp（TGG）变成终止密码子（TGA），从而终止蛋白质的合成。同样，由于不同的GJB2基因突变引起不同的听力衰减程度，即使在一个家庭中，携带相同基因突变的个体间同样存在显著差异。现阶段，虽然还无法对不同GJB2基因突变所致的临床症状下结论，但一些研究发现基因突变引起的临床症状具有明显特征。除此之外，GJB2基因中的隐形遗传突变有可能发生在任何部位，而显性遗传突变，如125delAGG，会引起轻度到重度的听力缺失，通常还会产生皮肤病症。 遗传基因的多态性并不伴随着相应的遗传性状，主要是因为某个个体DNA分子结构的变化，并不改变基因的功能和表达性状。通常在基因序列中，一些不参与蛋白质合成和无重要调节功能的区域发生突变会导致基因存在多态性，当这种突变独立产生作用时，并不引起疾病。相对于其他基因，GJB2基因突变的多态性表达较高，所以要明确GJB2的基因突变属于致病突变还是多态性表达是非常有必要的。现阶段的临床研究表明，在GJB2基因突变中，诸如G79A、A341G、T101C等在内的42种基因突变是多态性表达，其中仍有许多如109E-A突变等GJB2基因突变的归类还存在许多争议，这就需要更深一步的临床研究和实验进行验证。 对于生存习惯和环境不同的人群中，由GJB2基因突变造成的患儿听力缺失的影响也不尽相同。研究发现，生活在北欧地区的高加索人中，将近20%的听力缺失个体中发现有GJB2位点突变，在患语前聋听力缺失的韩国人中为5%，以色列人为43%。在北欧犹太教徒、高加索人和加纳人种中，在GJB2基因突变中，与听力能力缺失相关且出现频率较多的基因位点分别是35delG、167delT和235delC。而在我国，235delC的突变情况在不同区域也不一样，且纯合子与杂合子之间的比例也有差异。研究统计显示，东部235delC纯合子及杂合子出现的次数较西部偏多；在大部分地区，235delC杂合子与纯合子的比率大致相等。然而，部分区域，纯合子与杂合子的比率相差较大，如北京、吉林等城市，235delC纯合子频率约是杂合子的二倍。并且在不同民族之间，235delC的突变情况也有显著不同，如235delC等位基因突变在藏族出现的次数相对其他民族较低，而在满族中频率较高。 多年临床研究发现，感音性耳聋主要由GJB2基因突变造成，所以对有遗传病史的家庭进行遗传知识普及和教育并开展基因检测，以及对遗传性耳聋进行产前诊断是非常有必要的。 人的语言形成的关键时期是幼儿语前期，因此在新生儿的常规听力检查中，应增加GJB2基因检测，便于早发现、早诊断、早干预以及早治疗。对于一些产前诊断中，已经明确感音性耳聋的前提下，还可以通过遗传学指导和手段干预下，进行二次生育，避免再次生育由于遗传基因突变致聋的患儿。由于GJB2基因突变的类型多且杂，可通过对非综合征性遗传性耳聋患者的GJB2基因进行直接测序，在诊断出大多数已发现突变的同时，查出新的基因突变，为临床诊断、治疗提供理论支持和实验研究。 最后，相对遗传性聋这一大类疾病来说，上述已经明确疾病表型和致病基因的病种只是其中很少一部分，遗传性聋致病基因多且功能复杂，要实现从基因筛查到最终诊断的突破任重道远，大部分遗传性聋的明确基因诊断还依赖于未来临床诊断水平、分子生物学水平以及生物信息学发展。随着听力学、影像学等临床诊断技术不断提高，同时分子生物学技术不断发展使得基因筛查和检测不但变得越来越便捷和可靠，而且能够得到的遗传数据也越来越大，随着生物信息学的发展，这些大量筛查数据和成果的临床指导价值也将逐步清晰化，届时必将会有更多的遗传性聋能够完成明确的基因诊断。 参考文献 林晓江，陈东野，吴皓，等.一个常染体显性非综合征型耳聋大家系的临床特征及79个已知耳聋基因的检测分析.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2014，49（8）：654-658. 蒙翠原，盛晓丽，崔勇，等.广东省非综合征耳聋患者GJA1基因及常见耳聋基因突变分析.实用医学杂志，2013，29（7）：1075-1077. 张小芳，要跟东，李守霞.非综合征性耳聋的研究进展.医学综述，2013，19（1）：120-123. 崔庆佳，黄丽辉.GJB2基因突变与听力损失的关系.临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2013，27（19）：1099-1102. 梁鹏飞，王淑娟，王剑，等.陕西省800例非综合征型聋患者常见致聋基因突变分析.听力学及言语疾病杂志，2015，23（1）：11-15. 杜娟，许涓涓，黄萍丽，等.南宁市4679例新生儿突变耳聋基因筛查结果.山东医药，2015，55（43）：17-19. 刘水霞，胥亮，陈柏文，等.广西地区127例非综合征性聋患者常见致聋基因突变位点的筛查分析.临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2015，29（22）：1954-1958. 伍丽东，唐宁，严提珍，等.基因芯片联合Sanger测序技术在非综合征型聋患者基因诊断中的应用.听力学及言语疾病杂志，2015，23（6）：569-574. 林海波，刘庆仪.2109例新生儿听力和GJB-2基因联合筛查分析.牡丹江医学院学报，2014，35（3）：73-75. 代志瑶，孙宝春，黄莎莎，等.GJB2基因听力学表型与基因型关系分析.中华耳科学杂志，2014，12（1）：34-36. 曲长红，张宁，曹东华，等.240例耳聋患者常见耳聋基因筛查分析.解放军医学院学报，2014，35（10）：1019-1021. 胡煜，孙敬武，孙家强，等.非综合征型聋患者常见耳聋基因突变分析.中华耳科学杂志，2013，11（1）：121-125. 周黎红，郝子琪，刘薇拉，等.GJB2基因V27I和E114G位点与耳聋相关性的研究. 中国优生与遗传杂志， 2012，20（12）：49-50 14.郝津生，张亚梅，戴朴，等.非综合征型感音神经性聋儿GJB2基因突变分析.中国耳鼻咽喉头颈外科，2011，18（9）：487-490. 李建瑞，刘涛，严江伟，等.散发性耳聋GJB2基因突变分析.山东大学耳鼻喉眼学报，2011，25（6）：33-36. 徐志勇，高国凤，刘畅，等.耳聋患者及正常人GJB2基因的突变筛查.中华医学遗传学杂志，2009，26（2）：144-146. Denoyelle F，Marlin S，Weil D，et al.Clinical features of the p revalent form of child2hood deafness，DFNB1，due to a connexin-26 gene defect：imp lica2tions for genetic counseling.Lancet，1999，353（9161）：1298-1303. 韩跃峰.GJB2基因突变在遗传性非综合征性耳聋中的研究进展.医学综述，2012，18（17）：2774-2777. 董恩峰，戚本明，潘丽，等.与GJB2基因突变相关的遗传性非综合征性聋的研究进展.中华临床医师杂志：电子版，2013，7（4）：1742-1744. Xue Z L，Xia J X，Xiao M K，et al.The prevalence of connexin 26（GJB2） mutations in the Chinese population.Hum Genet，2002，111（4-5）：394-397. 冯永，刘亚兰.从遗传性聋基因筛查到基因诊断我们的路还有多远.中国耳鼻咽喉头颈外科，2015，22（2）：55-56.
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